20高效液相色谱.ppt

* 第20章 高效液相色谱法 High Performance liquid Chromatography (HPLC) 20.1 概述 高效液相色谱法（HPLC）：在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验方法，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，发展而成的一种现代液相色谱分析方法。 一、HPLC与GC差别 二、特点 一、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚 物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制, 分子量大、 难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均 可检测用途广泛 占有机物的80% GC：流动相为惰性气体 流动相与组分无亲合作用力，仅起运载作用；组分只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 2．流动相差别 二、HPLC的特点 ①适用范围广（可分析80%有机化合物，广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定） ②分离性能好 ③分析速度快 ④流动相可选择性范围宽 ⑤灵敏度高 ⑥色谱柱可反复使用（与经典色谱相比） ⑦流出组分容易收集 ⑧安全 20.2 HPLC的分类和基本原理 20.2.1 HPLC的分类 1．按固定相的聚集状态分： 液-液色谱法（LLC）和液-固色谱法（LSC） 2．按分离机制分： 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 分子排阻色谱 化学键合相色谱 亲合色谱 手性色谱 20.2.2 基本原理 塔板理论 速率理论 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即： H=A+ B/u+Cu → H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。 经典液相色谱法 + 气相色谱法 液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻抗是提高柱效主要途径 采用小粒度、窄分布的球形固定相，均匀装柱。A↓ 采用低黏度流动相，低流速。C ↓ ，u ↓ 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。一般恒温操作。 H = A + C u 由Van Deemter 方程式可以获得HPLC分离条件： 20.3 各类高效液相色谱法 20.3.2 液-液分配色谱法 根据流动相与固定相极性的差别，可将液-液色谱分为 极性小的先流出，适于极性组分分离 正相液-液色谱 流动相极性 固定相极性 反相液-液色谱 流动相极性 〉固定相极性 极性大的先流出，适于弱极性组分分离。 例如：含水硅胶为固定相，烷烃为流动相 20.3.3 化学键合相色谱法 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将固定液的官能团通过化学反应键合到硅胶表面上，而构成化学键合相。 1. 反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC） 采用非极性或极性较小的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系。 固定相：常用十八烷基硅烷键合相（ODS或C18） 流动相：常用甲醇-水或乙腈-水 适用：非极性~中等极性组分 应用最广，可解决80%的HPLC问题 流动相的极性与容量因子的关系 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 2. 正相键合相色谱法 （1） 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 （2）流动相：而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇等）为流动相。 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 （3） 分离极性化合物，极性强的组分后洗脱出柱 （4） 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 以极性的有机基团，如氰基(-CN)、氨基(-NH2）或双羟基等键合在载体表面，作为固定相。 正相色谱 低极性流动相 反相色谱 高极性流动相 中等极性流动相 中等极性流动相 时间 时间 时间 时间 待测物极性：ABC 正、反相色谱中极性和保留时间的关系 B + H+ ?