可编辑核酸酶的研究.docx

1.基因敲入原理可编辑的核酸酶在靶标位点产生目标DNA的双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs，引起细胞的NHEJ和HR两种DNA修复机制。非同源末端连接修复(nonhomologous end-joining, NHEJ)途径进行修复。NHEJ途径因缺乏精确性而导致修复的同时引入插入突变或者删除突变同源重组HR就是含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在产生DSBs的同时, 在靶标位置引入一个人工合成的同源修复模板, 细胞就会以一定的概率通过HR的途径修复,将目标序列整合到染色体中。同源修复模板主要是以质粒形式存在 称之为“donor质粒”。为了保证donor质粒能够和靶标序列进行重组, 一般需要两边有同源臂序列, 同源序列长度通常几百到上千碱基。HR介导的基因打靶被应用于各种模式生物的基因敲入(knock-in, KI)和敲除knock-out, KO)2. 可编辑的核酸酶2.1 锌指核酸酶(ZFN)ZFN（锌指核酸酶）由两个结构域组成，具有DNA结合功能的锌指蛋白(zinc fi nger proteins, ZFPs)和具有DNA切割功能的核酸酶Fok I。ZFPs（锌指蛋白）是一种具有序列特异性, 且可以灵活组装的真核细胞转录因子。ZFPs（锌指蛋白）一般由3~6个Cys2-His2锌指重复单位串联而成, 每个ZFP由约30个氨基酸组成, 可识别3个连续的碱基。ZFP-DNA共结晶的结果表明, 每个ZFP和DNA之间的相互作用很大程度上是功能自主的。于是就有人提出“积木组装”的概念, 即将几个不同ZFPs组装成能够识别特定的靶标序列的多肽, 并与核酸酶Fok I形成融合蛋白以实现基因组特异性切割的目的。因为Fok I只有其二聚体才具有核酸内切酶活性, 所以需要设计识别相邻序列的两个ZFNs才能实现对目的DNA的切割。研究表明, 当锌指蛋白识别目标序列后, Fok I更容易形成二聚体, 两个结合位点之间相隔4~7 bp效率较高。随着能够识别大部分三联体碱基的ZFPs的设计, 这种方法已经被运用到更高级的真核细胞中进行基因编辑, 然而由于价格昂贵、切割效率低限制了其应用。3.ZFN技术的缺陷ZFN技术虽然简易实用，但也具有一定缺陷。ZFN对DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化，并且需要至少一个识别单元结合DNA。DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但由于ZFN剪切的过程并不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段仍然受到现有生物学领域研究手段的限制，因此在细胞内部操作的精确程度和后果都较难预料。如果ZFN引起相关基因突变，则可能会导致一系列意想不到的后果，在与人体相关的应用领域，甚至可能引发癌症。另外，ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。并且到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（in vitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。而直接向患者体内导入相关ZFN元件进行基因编辑处理则具有较大的潜在风险，且效率不高。以上诸多限制导致人体相关的ZFN操作较为繁琐，难以推广应用。2.2 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)TALEN在结构和作用原理上和ZFN（锌指核酸酶）类似, 同样是由DNA结合蛋白和核酸酶Fok I构成, 同样是结合到相邻的两个目标序列区域, Fok I二聚体进行切割。主要的不同是DNA结合蛋白TALEs, TALEs发现于一种植物致病菌黄单胞杆菌中。TALEs蛋白由三个结构域组成: DNA结合结构域、核定位信号和激活基因转录结构域。TALE蛋白的DNA结合域由12~30个重复单元串联构成, 每个重复单位能够识别1个DNA碱基。每个重复单元由34个氨基酸残基组成, 其中第12、13位氨基酸残基是高度可变的, 因此被称为重复可变双残基(repeat variable diresidue, RVD。每个重复单位的RVD（重复可变双残基）负责识别1个DNA碱基, 不同的RVD能够特异地识别4种碱基中的1种或多种。和ZFN一样, 将不同的TALE重复单元串联起来, 设计出能够识别靶标序列的TALE。需要注意的是, TALEs识别的序列必须以T碱基开始, 有研究表明，这会影响TALEN的结合效率。虽然TALE重复单位识别的是单个碱基相对于ZFPs识别三个碱基具有更大的灵活性, 但因重复序列多而导致的分子克隆和构建载体困难是其一大缺点。为了规避这个缺