53血红蛋白的提取与分离2.ppt

* * 教学目标 教学重点 教学难点 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的分离－－样品处理 凝胶色谱法的原理 电泳法分离大分子的原理 一、基础知识――蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 1.凝胶色谱法 （1）原理： （2）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 1.凝胶色谱法 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等 1.凝胶色谱法 （4）缓冲溶液－－洗脱剂 组成： 配制： 作用： 调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 2．凝胶电泳法： （1）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2．凝胶电泳法： （2）分离方法： （3）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 二、实验操作－－实验步骤 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白 血液组成成分 阅读思考： 血液由______和________两部分组成。 血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。 该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 蒸馏水的作用是______________________________。 加入甲苯的作用是____________________________。 充分搅拌的目的是____________________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 4.透析血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL 粗分离－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱