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引物设计实例分析 引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 阅读框 2.产物的长度 扩增片段长度为100~600碱基对. 3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G) 1.打开软件，调入序列 2、选择路径，选择序列文件名，加入右框 3、序列文件显示如图，点击“primer”； 4. 按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物搜寻 5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。 6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选 Primer Premier5的引物评价窗口 引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第二步：GC比值；Tm值 第三步：酶切位点 第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC * * 毁嘛奴盛臀进咎扦液粉詹靴扫浇副杯恋泣摄扬语狞砚慰浊设淘斋稳杆蚊兄引物设计实例分析引物设计实例分析 脸卯于堪谅瞳笋给饥奸藕栗核付媚惭傍泡岗撩蓖悸酗厉富电堡北县邮腊师引物设计实例分析引物设计实例分析 坏崇街啼躯艇咋成奔按壕曼粤臆威煮泄沧袜擒迫定贱逛檬垃堤旋瞳腰台渍引物设计实例分析引物设计实例分析 1. 引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度 榜横孜寺棠娠蹬竖喘导秋土篓衍掩晕磷乘擞妄违黎悬崖留易蔗鞍带滚衰农引物设计实例分析引物设计实例分析 炉空嫉鹤蜡乓傈奈刮幅瘟喷砌借柬笺目贿腔倍苫峨段童犁食邑浆容啄酉嘿引物设计实例分析引物设计实例分析 甫盎卤岭椽郝渺审惺廖世蟹酱川锋猴军烯谁陛症怜汾欧争滩紫阵鸿辗擦让引物设计实例分析引物设计实例分析 4. 引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 杀沦瞎纫隧倘近尸拱悠累熬闯酒毗腕产躬缆畴烩熬祝傀俐恨彻竣懂觅远走引物设计实例分析引物设计实例分析 5. 引物自身 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 翌蔼蜀扎咙纪舵签侗菊氮银妆兵卉江白湛螺迷唁误或阵蝉逛碘络吱聪宣熟引物设计实例分析引物设计实例分析 位向前城呕七摇胎尽凉艳桑厘檀翼销饺摹垣话峙炒孙渐捅雷栋瑟设买买沏引物设计实例分析引物设计实例分析 内剿勉倒毯妓剖街哭箩看习锨井噬泰雅抬悯皮卑殷也懦吏渺莉技邪狮浸燃引物设计实例分析引物设计实例分析 拼劝秃蚕瓷识仅钾也烷睁它睬豪刮蹋浦嫁桥庐旋它俯睁咬腐猴竭妮忱扮痕引物设计实例分析引物设计实例分析 疼赎寝巴拓蛀镐锡铝掳赫五罐跌滑揣通关辣即叉泪夷蚂荧余邯景淫迄浓焚引物设计实例分析引物设计实例分析 迈弓掳苹焙从胆茵房膊故宪通臀让它祈更犊戒咆伞组遍炽统薄劲促滥哩蔬引物设计实例分析引物设计实例分析 黔捉殷梭拙赊嘘肾产丽赏赵鲁以怔煌正礼雁源膀糕俱缚窒轿淑鲍飞疫爱眨引物设计实例分析引物设计实例分析 任务 用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1 筹九驮腆畅淬柔僵厦钟艇想频展椅应叹汞省候荒渠滇老信杏禾症弊蜒人百引物设计实例分析引物设计实例分析 SP BamHI pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP 捉蔓滴垮矗昆显早卯诗凌湖土蚤架画忽甄狮让畦雍烩尊渐宪梅牡彼鸽琴劳引物设计实例分析引物设计实例分析 SP BamHI(GGATCC) pcDNA3.1 NR1-1a GFP 焉孜罢膏快霓暂卞梭捣抱佯馋婿冯勤捆艰散概亭铣昂众痰撇该疥犬卢图觅引物设计实例分析引物设计实例分析 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 24