PCR基础教程范本.ppt

PCR基础 质监部 钟少芬 体内DNA合成过程 半保留复制 半不连续合成 :一条链是连续合成的(前导链leading strand), 而另一条链（随从链，lagging strand）是不连续合成的：冈琦片段。 体内DNA合成过程 合成过程： 1、螺旋的松弛与解链 2、引发 ：引物酶（primase）以DNA为模板，自5‘→3’合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸。 3、 DNA链的延长 反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppiDNA 聚合酶：催化5‘→3’ DNA合成；3‘→5’外切酶活性：去除 错误碱基，有校对作用；5→3外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。 4、连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3,5磷酸二酯键相连，需ATP供能。 体外DNA合成 PCR-多聚酶链式反应 DNA聚合酶： 1、催化作用特点：高效 2、可以纯化分离 3、酶活力和纯度可以测定 4、条件满足，体外可以模拟（发生！） PCR反应的三个阶段 变性：反应模板形成单链模板，93℃-96 ℃。 复性：引物、探针与模板特异性结合，50 ℃ -68 ℃ 。 延伸：DNA合成（探针破坏，产生荧光），60 ℃ -75 ℃。 35-40 循环。 临床节约反应时间：复性和延伸合并一个温度。 典型反应条件举例 循环条件：