生物化学15讲课.pptVIP

* * 第十五章?? 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成 一、核酸的分离、纯化和定量测定 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。 （一）DNA分离 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。 （二）RNA的分离 RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200℃，8h 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂 ★用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法 ★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法