核酸提取原理及常见问题.pptx

核酸提取原理及常见问题内容第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、　原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取常见问题、 原因分析及其对策DNA提取的几种方法　基因组DNA的提取　CTAB法　SDS法　酚氯仿法 试剂盒法 CTAB法（植物DNA提取经典方法）　CTAB法原理CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形成复合物。在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定程度( 0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B —核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 ,而 CT A B 则溶于乙醇.注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl（pH8.0）　EDTA （pH8.0） NaCl CTABβ-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到DNA 分子上而致 D N A 降解；多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉淀下来，影响植物核酸纯度。改良方法1　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVPβ-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)2-5%(W/V)1-5%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。 改良方法 2加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞，去除部分杂质，离心得到细胞核；针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS清洗2-3次，去除多糖；后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP　CTAB法流程图酒精沉淀植物材料裂解液液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解SDS法 SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法DNA提取缓冲液　组份Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH 8.0 ）　NaCl SDS　终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂质抽提动物组织离心洗涤组织匀浆干燥溶解上层溶液DNA溶液酒精沉淀细胞裂解 SDS法流程图酚氯仿裂解法苯酚抽提原理：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用酚的缺点： 能溶解10-15%的水。 最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶 液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl?或?NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑