植酸酶活性测定--钼蓝法.docVIP

植酸酶活性的测定——钼蓝法 1 原理 针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。 植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3?MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。 酶活力单位：在37℃、H5.0条件下，每分钟从植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷为1个酶活力单位.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。 2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。 2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。 2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。 2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。 3 仪器设备 恒温水浴锅，分光光度计（有10mm比色皿），磁力搅拌器，涡流式混合器，酸度计（精确至小数点后两位），离心机（最高转速4,000rpm以上），其它实验室常用设备。 4 标准曲线绘制将4.0mmol/L磷酸二氢钾标准溶液用乙酸缓冲液（2.2）稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按表1的操作步骤一起反应。以无机磷含量为纵坐标（0.2ml以上稀释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。 5 样品测定 5.1 试样溶液的制备建议称取5-10g含酶饲料，精确至0.01g，置于100mL容量瓶中，加入乙酸缓冲液（2.1）定容（之前需充分搅拌20min），取其中2-10ml置于另一100ml容量瓶中用乙酸缓冲液（2.2）定容。稀释的最终结果应使样液浓度保持在0.02-0.06U/mL.左右，待反应。 5.2 反应 按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物（2.3）开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃保温30min。 反应步骤及试剂、溶液用量见表A1。 表1 反应顺序 样品，标准 样品空白 标准空白 样品稀释液（ml） 0.2 0.2 — 乙酸缓冲液 (2.2)（ml） — — 0.2 37℃预热5min √ √ √ 依次加入底物（2.3）（ml） 0.8 0.8（第二步） 0.8（第二步） 混合 √ √ √ 37℃保温30min √ ― ― 依次加入终止液（2.4）（ml） 1.0 1.0（第一步） 1.0（第一步） 依次加入显色剂（2.7）（ml） 1.0 1.0 1.0 混合 √ √ √ 总体积（ml） 3.0 3.0 3.0 A5.3 样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计700nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品植酸酶的活性。 A6 结果计算和表示 植酸酶活性U按下式计算：U =×F 其中：U——样品植酸酶活性，U/g；K——标准曲线斜率； F——样品溶液反应前的总稀释倍数； S——样品测试量，表1中S＝0.2ml； V——反应总体积，表1中V=1ml； m——试样质量，g； A0——测定样品空白吸光值； A——样品溶液吸光值； 30——反应时间，min。 两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。 A7 允许差同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于8％。Determination of Phytase Activity——Molybdate-Blue Method A1. PRINCIPLE Determination of phytase activity is based on the colorimetrical reaction between ammonium molybdate and free phosphorus which released from by the hydrolysis of phytate. The product solution painted in blue is measured by spectrophotometer at a wave-length 700nm, the measured absorbency quan