GPD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验_培训课件.pptVIP

——G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查 分子生物学设计性实验 2010级临床八大班 第四实验室 组员： 主讲： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)， 尿液镜下未见红细胞。 案例： 1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ 蚕豆病起病急遽，大多在进食新鲜蚕豆后1～2天内发生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期的长短与症状的轻重无关。　　本病的贫血程度和症状大多很严重。症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例症状持续2～6天。最重者出现面色极度苍白，全身衰竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安，少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。 蚕豆病发病机理： 1.蚕豆病的遗传机理 蚕豆症是一种性染色体隐性遗传,意思是女性的一对X性染色体都带有疾病基因才会发病，男性只有一个X性染色体，所以只要这个X染色体异常就会发病。只有一个异常X染色体的女性没有症状，但是她们所生的男孩如果得到这个异常的X染色体，就会发病。 2.蚕豆病的诱发机制 蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病，与体内红细胞缺乏葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PD）有关。在正常情况下，人体红细胞有一种具抗氧化作用的物质——谷胱甘肽。G－6－PD缺乏者，谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少，致使红细胞对氧化作用十分敏感。? 食入新鲜蚕豆后，蚕豆中所含的巢菜碱甙物质，可使血液中的氧化性物质增多，导致红细胞被破坏，从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶血性反应。 2.请设计实验进一步明确诊断 要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。 G6PD缺乏症的检查方法： 高铁血红蛋白还原实验 变性珠蛋白小体生成实验（可做为G6PD缺乏的筛选实验） G6PD活性测定 G6PD荧光斑点实验（特异性较好、方法简单） 抗坏血酸-氰化物实验 硝基四氮唑蓝定量法 G6PD比值法 高铁血红蛋白还原实验 …… 高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 实验名称：高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 实验原理： 在有足量的还原辅酶Ⅱ（NADPH)存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞色素b5（黄素酶）还原成亚铁血红蛋白。在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与。但红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。 高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 实验试剂： 0.18 mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混溶液 亚硝酸钠1.25g、葡萄糖5.0g、蒸馏水溶解，并加至100ml储存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存一个月 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 亚甲蓝（含3个结晶水）0.15g，蒸馏水加至100ml。先将亚甲蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，在再加蒸馏水至100ml，混匀过滤，此液可贮存3个月。 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）磷酸氢二钠229.5mg、磷酸二氢钾52.2mg，加蒸馏水至100ml。或用0.0667mmol/L PH 7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。 109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L） 高铁血红蛋白还原实验