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天津商学院专业基础试验室开设设计性试验一览表 生物化学实验：XXX酶的提取及动力学分析 实验目的：掌握酶及蛋白的分离提取技术及方法； 学会评价酶催化特性的有关知识。 实验要求：1 采用两到三种方法对酶进行分离纯化，然后进行相关分离指标的比较； 2 利用评价酶分离纯化的酶表对分离纯化方法进行评价； 3 研究影响酶促反应的因素（温度、pH、Km和Vm、酶的操作稳定性等） 考核方式：按论文写作格式要求写出实验报告。 酶工程实验：XXX酶的发酵生产及产酶动力学分析 实验目的：1 掌握产酶微生物的培养技术 2 产酶微生的发酵工艺条件及其控制 3 酶发酵动力学 实验要求：1 学会细胞活化与扩大培养技术 2 培养基配制技术 3 温度、 pH、溶解氧的调节技术 4 提高酶产量的措施 5 细胞生长动力学 6 产酶动力学 考核方式：按科技论文格式写出实验报告 酵母蔗糖酶的动力学性质 生物化学课程组 郑丽媛 龚莎莎 徐迅 摘要：本实验通过对啤酒酵母中蔗糖酶的提取纯化，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质测定，作初步的研究。通过一系列试验，研究蔗糖酶的最适pH、最适温度、蔗糖酶催化反应的活化能，测定米氏常数Km 、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数KI ，由此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。本文对此系列实验进行了整理和总结。 关键词： 蔗糖酶 米氏常数Km 反应速度Vmax 最适pH 最适温度 抑制剂常数KI 二硝基水杨酸 引言：自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（(—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的(—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。从20世纪50年代起分光光度法测酶活性以其测定范围广、准确、简便、快捷等优点广泛流行。下面将通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质进行具体地研究。 1实验器材及试剂 1.1器材 1.1.1研钵 离心管 滴管 烧杯 移液管 吸耳球 试管 盖子 试管架 1.1.2恒温水浴锅 1.1.3高速冷冻离心机 1.1.4广泛pH试纸 1.1.5紫外分光光度计 石英比色皿 1.2材料及试剂 1.2.1啤酒酵母、二氧化硅、去离子水（4oC）、冰块、1mol/L乙酸、95%乙醇 1.2.2 0.2mol/L,pH4.9乙酸缓冲溶液 葡萄糖4mmol/L 果糖4mmol/L 二硝基水杨酸溶液 1.2.3 0.2mol/L的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 柠檬酸 乙酸钠 乙酸和8mol/L脲 2实验方法 2.1 酵母蔗糖酶的制备 2.1.1 提取 a.准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 b.称取10g湿啤酒酵母，适量（约5g）二氧化硅放入研钵中,二氧化硅要预先研细。 c.缓慢加入预冷的30ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。至酵母细胞大部分研碎，以便将蔗糖酶充分转入水相。 d.将混合物转入两个离心管中，平衡后用高速冷冻离心机离心，4 oC10000r/min 15min。 e.用滴管小心取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4 oC1 000r/min 15min。 f.将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液pH，用1mol/L乙酸将pH调至5.0，为“级分I”。留出1ml左右测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2.1.2 热处理和乙醇沉淀 a.预先将恒温水浴调到50oC，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50oC下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 b.取出离心管,于冰浴中迅速冷却，4 oC, 10 000r/min，离心10分钟。 c.将上清液转入小烧杯中，放入冰浴，缓慢地加入等体积预冷至－20oC的95%乙醇，同时轻轻搅拌，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4 oC，10 000r/min，离心10分钟，倾去上清液，滴干，沉淀保存于离心管中，放入冰箱中冷冻保存。 2.2 底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax测定 2.2.1 标准曲线的制作 本实验和下一个实验均采用二硝基水