第3章蛋白质的结构与功能详解.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3.7.7.4利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 3.7.7.5 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 3.7.8. 蛋白质含量测定和纯度鉴定（略） * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3.7.2蛋白质的电泳 蛋白质颗粒电泳时， 迁移率由以下因素决定：所带电荷分子量分子形状 3.7.3 蛋白质分子的大小及分子量测定 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿 (1) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基亲油（蛋白质疏水区） 凝胶法只适于球状蛋白分子测量 蛋白质混合样 (2) 凝胶过滤法 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 (3) 沉降速度法 3.7.4 蛋白质的胶体性质 胶体溶液的特点是什么？ 分子直径在1-100 nm内，溶于水，且不易聚集沉淀（稳定）。 大多数球状蛋白，分子直径在胶体溶液范围。溶于水，能形成稳定的胶体溶液。 蛋白质胶体溶液的稳定的原因是什么？ 1.同种蛋白质带有同种电荷，相互排斥，与反离子构成双电子层； 2.水膜弹性 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 透析与膜过滤 利用蛋白质分子较大，不能透过半透膜的性质，用半透膜将蛋白质与无机盐、单糖等小分子物质分开，半透膜一般用玻璃纸或一些合成材料。 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐溶—盐析 分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中 盐溶 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。分段盐析法 盐析（（NH4）2SO4） 3.7.5 蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 Ⅱ (1) 盐析法：加入中性盐脱去蛋白质的水化层。盐析一般不引起变性 (2) 等电点沉淀 (3) 有机溶剂沉淀：脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 (4)重金属盐沉淀：重金属离子与带负电荷的蛋白质结成不溶性盐 (5)生物碱试剂和某些酸类沉淀：和带正电荷的蛋白质生成不溶性盐 (6)加热变性沉淀：使蛋白质天然结构解体，破坏水化层，破坏带电状态 3.7.6 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活 1.前处理：根据动物组织，植物组织，细菌采取不同的处理方法 2.粗分级分离：采用盐析，等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等 4.结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤 3.7.7 蛋白质的分离纯化方法 3.7.7.1 根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 2、密度梯度（区带）离心 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 3、凝胶过滤 3.7.7.2利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀调整溶液pH不同蛋白在各自 pI处依次沉淀2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 3.7.7.3 根据电荷不同的分离方法—电泳 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 1、对角线平板电泳 2、等电聚焦电泳 双向电泳 3、 离 子 交 换 层 析 研究对象：几个亚基，相同否？ 怎样连接作用力：稳定四级结构的作用力：结构互补（极性）和非共价键主要由疏水相互作用驱动缔合