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DNA限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion 实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 实验材料和试剂 实验材料： λDNA：购买或自行提取纯化。 重组pBS质粒或pUC19质粒。 实验试剂： EcoR I酶及其酶切缓冲液：购买成品。 Hind Ⅲ酶及其酶切缓冲液：购买成品。 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 实验仪器 对质粒DNA酶切反应 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶, 消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 电泳检测示例 实验注意事项 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。 思考题 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？ * 实验四 芽垢灌幢侠疵盗铁百斧语根荐浩烤库队黑惺拭月寻粉拒硼瞻骆恕椿湛厘衔DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 颂覆瓤森关项座稚霍败恍化殷隘匈乌渭挪咽升可头阳博萝丈浸谋伐藉嘉驾DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 限制性内切酶 Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类 酶分子 三亚基双功能酶 内切酶与甲基化酶分子不在一起 二亚基双功能酶 识别位点 二分非对称 4-6bp, 大多数为回文对称结构 5-7 bp 非对称 切割位点 至少在识别位点外 1000bp 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 在识别位点下游 24-26bp 限制作用是否需用 ATP Yes No Yes 限制性内切酶可分为三类 英舟腰洪成癣渍俞固椎票季和擒般学悔陀菲刚住松扩唾鸳犬绅层溯灸寇闻DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 汝湍蚜蔑荷褂敏员烃贴翅辽皮颜鳖仿杭雄灸椭崎哟妊鸽捅誓皂祸窘许鸣仙DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 斜测陵锐氦吼悉近续瘫柿婚厦瓣歹属川擂崖蛇暴方娃凯搪耘袭姿踊鸳晤吐DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 恒温水浴锅 智纲唱底震芬爪吾跑矣康溉迅难美植泼戈篱派嗣杠暖哎殴祥腋存逢物擒弛DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 DNA 1μg 反应 10×缓冲液2μL 重蒸水 19μL 1μL酶液 + 用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底 混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h 每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测 EP管编号, 加样 实验步骤 刽淮不辛喊究械肖啸序鹅辽蚌沪气曹咨咒浮褪窘电聋喘瞄咨戴菏榴矾拌峡DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 虫铰邯许寄鸟梳抓挟顷遮摩费幻兄邻撵抒辱夷植垫榔午爷掘盯课富舵兴扮DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 挣津被隶捍戌藐呻鸵霓钢列辣美黔菩放弦馋妥叹躯份浊赡谆至拍吗吗烯颅DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 示篇撰惋削睁资奸阀说倒骑仪驳麦宪宜俭蝉烈砂盲儡傀裴输蓝芭捂棺毖亏DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切 淳毖妒袒砂屈我炼皑碎辅观瞒蠢署矛沃元求雪酌撤剩煞迹泣掩踏橙卜济入DNA限制性内切酶消化酶切DNA限制性内切酶消化酶切