20131223-蛋白质原理与技术n教程范本.ppt

思考题 已知某耐热微生物的基因a，其编码蛋白A的预测为磷酸化酶，请设计方案对该蛋白进行原核表达纯化及鉴定。写出具体步骤，理由及检测方法。 Thank you ! * * * * * * * * （一） 酵母双杂交技术（Yeast Two Hybrid） （二）细胞内蛋白质共定位（Co-localization ） （三）谷胱苷肽-S-转移酶沉淀 (GST-pull down） （四）免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP） （五）质谱（Mass spectrum ） （一） 酵母双杂交系统 酵母激活因子 GAL4： N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain, BD)， C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain, AD)。 BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。系统组成部分： （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带一个或多个报告基因的宿主菌株。 1. 原 理 BD X COOH AD cDNA NH2 COOH 共转化