基因表达半定量PCR检测.docVIP

基因表达的半定量PCR检测实验目的： 以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。 实验原理： 真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。 PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。 变性（denaturation）（95）；退火(annealing)；延伸(elogation)（72） 图3-1 PCR扩增DNA原理示意图 图3-2 PCR实验中各种组分的剂量： （1）dNTP常用浓度为20~200μM，不能低于10~15μM。 （2）引物浓度一般在0.1~1.0μM。 （3）Mg2+ 浓度范围通常为0.5~2mM。（3）在100μl PCR反应中，1.5~2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。 （4）一般反应中的模板数量为102~105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA；扩增多拷贝序列时，用量更少。 （5）反应缓冲液：反应缓冲液一般含10~50mM Tris-HCl (20下pH8.3-8.8)，50mM KCl和适当浓度的Mg2+。Tris-HCl在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。 50mM的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mM的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。 PCR既可以扩增制备全长基因（图3-3），也可以扩增基因片段（图3-4）。 图3-3 PCR扩增全长基因 图3-4 PCR扩增基因片段 Two-step RT-PCR 实验材料： [1].cDNA：实验2获得的cDNA。使用前用紫外分光广度计测定浓度。 [2].taq酶：5U/μl；附带10×PCR buffer (w/Mg)：20mM MgSO4, 100mM KCl, 80mM (NH4)2SO4, 100mM Tris-HCl, pH9.0, 0.5% NP-40。上海申能博彩生物科技有限公司。 [3].4×dNTP混合物：10mM每种单核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；上海申能博彩生物科技有限公司。 [4].小鼠GAPDH基因PCR扩增引物（扩增产物168bp）： GAPDH-F1：5- DIG/Biotin-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3 Tm值：54.8 GAPDH-R1：5- DIG/ Biotin-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3 Tm值：55.7 [5].小鼠GAPDH全长基因PCR扩增引物（扩增产物1002+14 bp）： GAPDH-F2：5′- GCGGGTACCATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′ GAPDH-R2：5′-CGCGTCGACTTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3′ 上游引物内含KpnI酶切位点（下划线者）；下游引物内含Sal I酶切位点。 [6].小鼠 β-actin基因PCR扩增引物（扩增产物156 bp）： β-actin-F：5-CATCACTATCGGCAATGAGC-3 β-actin-R：5-GAC