医学硕士吴永琴毕业论文.ppt

报 告 流 程 研究背景 宫颈癌在全球女性癌症死亡率中位居第二,新发病例50万/年，出现年轻化趋势 75％以上的宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV） 16、18、31、45等型感染相关 HPV E6和E7蛋白在癌组织中呈高表达，可引发CTL反应，是理想的靶抗原 国外用HPVL1、E7蛋白检测患者HPV抗体的研究较多（真核表达系统） 本研究采用原核表达系统，操作简便，产量高，实用性强 HPV18型阳性患者的5年存活率低，复发率高 目的一： HPV18 E7基因重组质粒的克隆和表达 实验方法二：实验流程 进一步两两比较： 宫颈癌组较尖锐湿疣组及健康对照组抗体阳性率差异均有显著性意义（χ2 =9.601，P 0.01；χ2 =11.629，P 0.01） 尖锐湿疣组较健康对照组抗体阳性率差异无显著性(χ2=0.015，P 0.05) 利用HPV18 E7基因引物扩增目的基因，纯化后插入pET32a(+)表达质粒中，经过酶切分析和序列测定表明pET32a(+)/HPV18 E7重组原核表达质粒构建成功。 重组表达质粒转化后，通过不同时间和IPTG浓度梯度诱导表达，结果以IPTG浓度1mM，温度37℃，诱导9h表达量为最佳。 表达后融合蛋白经SDS电泳，与预期融合蛋白大小相符，以His抗体为一抗WB鉴定融合蛋白为目的蛋白，表明在His启动子作用下成功表达了HPV E7融合蛋白。 通过亲和层析柱纯化的方法较为简便，纯化后的融合蛋白以阳性患者血清为一抗，经WB鉴定表明该融合蛋白有与其相应血清结合的特性，并具有较强的抗原性（免疫反应性）。 以HPV18 E7融合蛋白作诊断抗原，采用ELISA法检测宫颈癌组、尖锐湿疣组和健康对照组血清特异性抗体，宫颈癌组与尖锐湿疣组、健康对照组间抗体水平均有显著性差异(P0.01)。 宫颈癌组血清抗体阳性率为17.0%。 原核表达的HPV18 E7融合蛋白用于研究宫颈癌患者血清特异性抗体的反应具有可行性，有望进一步用于血清学诊断的特异性抗原研究。 结 论 1. 成功构建了重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7。 2. 经IPTG诱导，大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了HPV18 E7融合蛋白，并成功纯化了重组蛋白。 3. ELISA法证明纯化后融合蛋白具有较强抗原性（免疫反应性），能与HPV18 E7阳性宫颈癌患者血清发生反应，为HPV治疗性疫苗及HPV血清学研究奠定实验基础。 致 谢！ 本文是在我的导师张丽芳教授悉心指导和严格要求下才得以完成的。在此衷心感谢张老师！同样要深深感谢姜丽萍教授，并向导师们致以最高的敬意和感激！ 衷心感谢医学院微生物学和免疫学教研室朱珊丽、文金生、李文姝、薛向阳、陈韶等各位老师在我学习和实验中给予的帮助和指导；尤其要感谢基础实验中心吴淑贞老师给我的技术指导和心理支持！ 感谢郑丹、欧琴、石朝辉、陈军、孟锐锋、陆丽君、应小俊、刘建晓、李玲玲、张琴、郑美霞等师兄弟姐妹们对我实验过程的帮助指导！ 感谢护理学院全体教职员工在我读研期间给我的支持和帮助！ 衷心感谢我的家人，他们永远都是我生活和学习的支柱和动力！ 感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家教授在百忙之中对本文的指导！谢谢！ 标本来源 血清标本: 88例宫颈癌患者血清标本取自温州医学院附属一、二院妇产科择期手术的宫颈癌病人；65例尖锐湿疣患者血清标本中，53例取自温州医学院附属二院皮肤科及妇产科，12例取自温州地区平阳县医院妇产科；宫颈癌和尖锐湿疣患者均经临床诊断和组织病理学检查证实；77例健康对照组标本取自本院无宫颈癌体征和病史的体检者。均取外周静脉血3ml，分离血清-70℃保存。 HPV18型阳性宫颈癌患者血清:本实验室保存。 HPV为双链DNA病毒，属乳多空病毒科乳头瘤病毒属，病毒颗粒直径约55nm，核壳呈20面体对称，有72个壳粒，含近8000个核酸碱基对(bp)，分子量为5×106道尔顿。基因组按功能分为3区：即早期区（E）、晚期区（L）和长控制区（LCR）。E区编码的6个蛋白即E1、E2、E4～E7，在病毒复制和细胞转化中起重要作用；L区由L1和L2组成，Ll高度保守，L2高度可变，反映了HPV抗原的多态性。LCR含有RNA聚合酶所需要的启动RNA合成的核苷酸序列，从而调控基因的表达。HPV感染宿主细胞后病毒核酸整合到宿主细胞内，使宿主细胞发生突变并发展为癌。目前认为，整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6，E7和E2[3，4]。 HPV E6和E7蛋白是HPV的癌蛋白，在正常组织中少有表达，但在HPV感染引起的宫颈癌细胞和上皮内瘤样变细胞中能稳定并呈高表达，具有特异性的免疫原性，能引发CTL反应，有助于清除肿