现代色谱分析-HPLC1幻灯片.ppt

高效液相色谱法 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法与经典液相色谱法原理相同，无本质区别。 1. 新型高效输液泵，使分析时间缩短 2. 高效固定相，分离效能高，选择性好 3. 高灵敏度检测器 高效液相色谱法的应用范围 1. 高沸点、热不稳定、分子量大、不同极性的有机物； 2. 生物活性物质、天然产物； 3. 合成与天然高分子 涉及石油化工、食品、药品、生物化工、环境等领域。80％的化合物可用HPLC分析。 HPLC的局限性 1. 溶剂消耗大，成本高于GC, 梯度洗脱的操作也比GC的程序升温复杂。 2. 缺少通用型检测器。近年来ELSD应用日益增多，有望成为通用型检测器，但稳定性尚需提高。 3. HPLC不能代替GC，对于柱效要求高的分析，仍需GC，如石油产品。 4. HPLC 不能代替中、低压色谱，如受压易分解变性的具有生物活性的生化样品。 高效液相色谱仪 流动相及贮液瓶 1. 贮液瓶应耐腐蚀，用玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料。 2. 溶剂使用前必须经过0.45μm滤膜过滤，过滤用液相色谱专用滤膜或4号微孔玻璃漏斗。 流动相的脱气 1. 氦脱气法 2. 加热回流 3. 抽真空 4. 超声脱气 5. 在线脱气 高压输液泵 要求： 1. 泵体材料耐腐蚀。优质耐酸不锈钢，聚醚醚酮（PEEK) 2. 耐高压。40～50MPa 3. 输出流量范围宽。填充柱: 0.1~10 ml/ min(分析型），1～100ml/min; 微径柱：10~1000μl/min 4. 输出流量稳定，重现性好。 恒流泵－注射螺杆泵 注射螺杆泵的优缺点 优点：流量稳定，无脉动 缺点： （1）液缸体积有限，约100～150ml, 不利于连续工作。 （2）不能用于梯度洗脱。 恒流泵－往复泵 往复泵的优缺点 1.可在高压下连续输液 2.液缸容积小（几十～几百微升），适合于梯度洗脱 3.存在脉动 4.柱塞与流动相直接接触，易造成污染 恒压泵 又称气动放大泵 过滤器 脉动阻尼器 梯度洗脱－低压梯度 梯度洗脱－高压梯度 梯度曲线 进样装置－停流进样 进样装置－六通阀进样 进样装置－自动进样器 Agilent 1100 系列自动进样器 色谱柱 1. 柱材料 内壁抛光、钝化的不锈钢管 2. 规格 a.内径4.6或3.9mm，柱长10～30cm, 5~10μm填料, 柱效5000~10000/m b.内径4.6或3.9mm，柱长5～10cm, 3～5 μm填料 c. 内径0.5~2mm微填充柱 d. 内径30～50 μm的毛细管柱 湿法装柱 紫外检测器－固定波长检测器 紫外检测器－可变波长检测器 紫外检测器－光二极管阵列检测器 DAD三维色谱图 折光指数检测器 电导检测器 荧光检测器 蒸发激光散射检测器 电化学检测器 利用氧化还原反应的检测器 库仑阵列检测器 高效液相色谱的一种检测器 属于电化学一类 由数个多孔石墨电极串连组成 在一次试验中，可同时提供多个氧化还原反应电势 Chromatographic and Voltammetric Resolution 色谱工作站 ChemStation (Agilent 1100) Empower (Waters) CLASS VP (Shimadzu) 杭州英谱 N-2000千谱 ZD－1（本研究所研制） 固定相 内容： 固定相载体结构 正相色谱固定相 键合相色谱固定相 各种类型硅胶 吸附色谱保留机理 吸附色谱中的保留 硅胶柱和氧化铝柱的缺点 键合固定相 为了解决固定液的流失问题，将固定液通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相。 键合固定相对各种溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性，柱效高，使用寿命长，重现性好，可用于梯度洗脱。 键合固定相已取代传统的液液分配色谱，成为HPLC中主要的固定相。 键合固定相 键合固定相的类型 －Si－O－C－型 －Si－C型或－Si－N型 －Si－O－Si－C型 －Si－O－C－型 －Si－OH ＋ ROH －Si－O－R ＋ H2O 此类固定相柱效高，易水解、醇解，热稳定性差，只能用弱极性流动相用于分离极性化合物。 －Si－C型或－Si－N型 －Si－OH ＋ SO2Cl2 －Si－Cl（氯化硅胶） －Si－Cl ＋ RMgBr －Si－R （R=苯基或烷基） －Si－Cl ＋ NH2CH2CH2NH2 －Si－NHCH2CH2N