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14 植物种质保存 第一节 概 述 种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息 从亲代传递给子代的遗传物质。 种质库：是指以种为单位的群体内的全部遗传 物质，它有许多个体的不同基因所组 成。又称基因库。 种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。 种质资源低温保存（cryopreservation）:是将植物的细胞或组织经过防冻处理后，在-80以下的超低温下保存的方法。 种质保存的意义 随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。 种质保存的方法 按保存的地理位置分 ：原地保存和异地保存 原地保存:在原来的生态环境条件下就地保存，如建立自然保护区 ，天然公园等； 异地保存:将种子或植株保存于该品种资源原产地以外的地区，这种保存可采用植物园、种质园、种质库等形式或采用试管保存形式。 按照保存的具体方法分：种植保存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。  极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。 在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可用于长期保存植物材料。 意义： 可以在有限空间里保存大量资源 与种子保存相比，可以不受时间和高含水量的限制 与试管苗相比较，可以避免频繁继代而带来的变异 ，同时节省工作量。 现状： 据王军晖等（1998）统计，目前已有40多个属60多个种的木本植物被进行了超低温保存。 种子、胚、胚轴和体细胞胚的保存常用干冻法。 茎尖和分生组织的保存大多用玻璃化法和包埋脱水法。 一、细胞内外水的冻结性质 植物细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结。 由于细胞内含有复杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0℃左右结冰。理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25℃，而结合水在－100℃温度下也不冻结。 根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），细胞游离水的冻结温度（－30℃）可被认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法是以－30℃为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。 根据细胞内外水的冻结特性选择细胞冻存技术 逐步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，首先使胞外冻结。从而导致细胞内游离水向外渗溢使细胞适度失水，适度的细胞内脱水对冻存是有益的。 快速冷冻：即玻璃化冻存技术，加快降温速度，使细胞内水冻结冰晶体积非常小，出现玻璃化的冻结现象，从而也可以使细胞免受伤害，达到细胞冻存的目的。 二、低温下细胞致死损伤 细胞超低温贮存一般要经过： 预冻---超低温长期贮存---解冻 细胞致死损伤一般发生在预冻和解冻两个环节上 避免细胞致死损伤是超低温保存技术研究的重点 二 分级冷冻 两步冰冻法 分级冰冻法 两步法： 第一步：降温至转移温度。样品在添加冰冻保护剂后，用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某个速率将样品降温至转移温度（一般为-40至-70）。 第二步：将处于转移温度下的样品置于液氮贮存。 逐级冰冻法： 将经保护剂处理的材料在0度预处理后，依次通过不同温度的冰浴，如-10，-15，-23，-40等。一般每级约停留5分钟，然后浸入液氮。 三、玻璃化冻存 玻璃化（vitrification）:指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。当抗冻剂溶液(如甘油、丙二醇等）浓度为40%-60%（W/V）时，较容易形成玻璃化。 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后，复温时要快速化冻，防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。 一、材料的基本特性 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。 植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞成活率的最重要因素之一。指数生长期和滞后期的细胞抗冻力强，存活率高。 二、预培养和低温锻炼 预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含