2、光生物物理学课件.pptVIP

一、物质的检测 1、荧光物质检测 检测微量抗原或药物 荧光偏振与免疫学方法结合——免疫荧光偏振法 原理：利用生物大分子体系荧光偏振度P的大小与分子的大小成正比关系，以及抗原、荧光标记抗原与抗体结合而形成的一种技术。 结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。 一、物质的检测 2、酶反应动力学 乳酸盐 + NAD+ 乳酸脱氢酶 丙酮酸盐 + NADH + H+ NADH： ?ex：340nm ；?em：450nm 测定乳酸盐浓度：固定NAD和乳酸脱氢酶浓度，加入不同浓度乳酸盐，测一定Δt内的ΔF，作ΔF / Δt对乳酸盐浓度的曲线——标准曲线。 乳酸脱氢酶活性或浓度 一、物质的检测 3、生物大分子的结合研究 生物大分子构象 氨基酸或发光基团所处环境：疏水、亲水、极性大小。 320~360nm 308~320nm ?em 亲水 非极性 色氨酸 蛋白质构象：酶活性中心位置或环境 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 荧光物质：通常都具有环状共轭双键（π） 天然生物分子：的只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子。 蛋白质：只有含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸时才具有荧光特性。 核酸：除碱基外也不发荧光。 脂质（脂组成的膜系统）：无荧光特性。 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 天然荧光生色团结构特点 碳原子骨架 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。如：对苯基化，间苯基化等。 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 天然荧光生色团结构特点 分子的几何排布 具有刚性平面结构 荧光素 C O O C O O H H O 酚酞 C H O C O O H H O H 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 天然荧光生色团结构特点 取代基的类型 加强荧光的基团：给电子取代基，如，-NH2、 -NHR、 -OH、-OR、 -CN、-OCH3、-OC2H5 减弱荧光的基团：得电子取代基，如，-CO2H、-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-SH、-F、-Cl、-Br、-I 影响不明显的基团：-R、-SO3H、-NH3 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 天然荧光生色团结构特点 取代基的位置 邻位、对位——荧光增强 间位——荧光减弱（-CN基例外） 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 色氨酸 Tryptophan （W，Trp） CH2—CHCOO- +NH3 N 酪氨酸Tyrosine （Y, Tyr） —CH2—CHCOO- HO +NH3 蛋白质和核酸中的荧光生色团 苯丙氨酸Phenylalanine (F, Phe) —CH2—CHCOO- +NH3 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 荧光探剂（针） 荧光探剂（针）：根据小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为~。 荧光标记：利用荧光探剂标记到无荧光的分子或系统内，以研究后者的特性，这种方法称为荧光标记。 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 荧光探剂（针）分子的基本要求 能产生稳定、较强的荧光； 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固； 探针的荧光必须对环境条件比较敏感； 结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 荧光探剂（针）的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针。 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。 细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 。 离子荧光探针：Ca2＋、 Mg2＋、Zn2＋ 、Na＋、 K＋， Cl-等。 一、荧光分光光度术中的参量 5、荧光探剂 荧光探剂（针）的应用分类 pH荧光探针：近中性pH应用的探针、酸性、探针交联物。 活性氧和一氧化氮探针 细胞骨架蛋白荧光探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂 第三节 荧光分光光度计及影 响荧光测量的因素 入射的激发光与荧光探测方向垂直，可避免入射光的干扰，也有采用90o以外方向夹角。 UV-VIS 光源 90o 单光束荧光仪的仪器结构框图 检 测 器 发射波长 选择器 样 品 室 激发光波 长选择器 输出和 控制装置 一、荧光分光光度计仪器结构 UV-VIS 光源 90o 检 测 器 发射波长 选择器 样 品 室 激发光波 长选择器 输出和 控制装