第六章 酶与细胞固定化课件.ppt

* * * * 采用中空纤维为载体进行植物细胞固定化是把植物细胞定置在中空纤维的外壁与外壳容器的内壁之间，细胞吸附在中空纤维的外壁，培养液及氧气在中空纤维的管内流动，各种营养成分及溶解氧透过中空纤维的半透膜管壁传递给管外壁的细胞，植物细胞的代谢产物又通过中空纤维膜分布到管内培养液中，随培养液流出。这种方法近似于植物体内物质的传递与交换形式，有利于细胞生长和新陈代谢的进行。中空纤维作为固定化栽体的缺点是有时纤维管会阻塞而影响物质传递，而且中空纤维成本较高，难以大规模生产应用。 * l979年，Brodelius等人首次用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化长春花细胞、毛地黄细胞和海巴戟细胞，开创了植物细胞固定化的研究。此后．此技术迅速发展，已有不少成功的报道。 * 1972年Kuazek首先研制成功中空纤维培养器，用于动物细胞固定化，现已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化，以生产各种单克隆抗体和疫苗等。 五、固定化动物细胞 1、动物细胞固定化方法： 主要为吸附法与包埋法 (1) 吸附法： 大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面．故吸附法特别适合于动物细胞的固定化。 操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。 常用的吸附载体有转瓶、微载体和中空纤维等。 a. 转瓶吸附： 转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。 培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面积(S／V，表面积与体积之比值)较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。 b. 微载体吸附： 微载体是指颗粒细小的固定化载体．直径一般为100～200um，相对密度接近l.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。 微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于生产β-干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。 c.中空纤维吸附： 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。 使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁．培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。 现在已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化。中空纤维固定化适用于动物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。 中空纤维培养器的缺点是：中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。 (2) 包埋法： 一般适用于悬浮细胞。 根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种。 a. 凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性．可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。 琼脂凝胶包埋法 1~2.5%琼脂糖 溶化 冷却至37～38℃ 加动物细胞 降温至1O℃左右，得到直径为0.1～0.3mm的微球状固定化细胞。 海藻酸钙凝胶包埋法 海藻酸钠水溶液 ＋ 灭菌 动物细胞 滴入氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞。 血纤维蛋白包埋法 血纤维蛋白原 ＋ 动物细胞 ＋ 凝血酶 血纤维蛋白 b.半透膜包埋法： 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。 制备过程：采用海藻酸钙～聚赖氨酸(ALG-PLL)包埋技术 动物细胞先用海藻 酸钙凝胶包埋．制成直径l～2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。 2、固定化动物细胞特点 (1) 提高细胞存活率： 动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。 (2) 提高产率： 动物细胞固定化后，可先在生长培养基中繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期。以利于提高产率。 (3) 可反复使用： 固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化自动化生产。 (