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* 第三节 酶活力测定方法 固定时间法 连续监测法 （一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 直接测定法 偶联法 三联酶活测定 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 固定浓度法 * 第四节 酶活性测定方法的设计 一、影响因素 二、底物与产物的测定方法 三、测定条件的选择 1、单因素选择 2、正交设计——多因素选择 * 第五节 酶类药物的检测 肽键水解酶 1、胰蛋白酶 2、弹性蛋白酶 3、尿激酶（气泡上升法） 脂键水解酶——胰脂肪酶 糖苷键水解酶 ——溶菌酶 其它（超氧化物歧化酶，门冬酰胺酶） * 方法: * 3、尿激酶（Urokinase） 由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。 主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原使其成为有活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。 天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。 * 效价测定原理(气泡上升法) 尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶； 纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。 在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。 * 操作(气泡上升法) 试管中加纤维蛋白原溶液0.3ml（37℃水浴） 标准品(或供试品) 1.0ml 加混合溶液0.4ml 立即摇匀计时，反应系统应在30～45秒内凝结，当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。 以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。 * 二、脂键水解酶－ 胰脂肪酶(Pancreatic Lipase ) 胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘油三脂类脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸。 底物:橄榄油 用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量，从而得知脂肪酶活力。 * 测定 * 计算 每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸的酶量，为1个活力单位。 每克含有的胰脂肪酶单位 A:供试品消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 B:空白消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 W:供试品取样量（g） N:供试品稀释倍数。 * 三、糖苷键水解酶 －溶菌酶 蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶。 溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作用。 溶菌酶分子量为14000～15000，由129个氨基酸残基组成，等电点为10.0~11.1。 溶菌酶属糖苷键水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。 * 溶菌酶作用位点 * 青霉素 转肽酶底物末端的二肽D-Ala-D-Ala结构 * 效价测定－比浊法 以溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重复而成。 只能水解NAM C1 和NAG C4之间的β－1，4糖苷键。 溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，导致溶菌，溶液的吸收度下降。 在一定的条件下，每分钟吸收度下降0.001为一个酶活力单位。 * 比浊法测定 计算： 酶活力单位（u/mg） = W为测试液中供试品的重量（μg） * 比色法-测定溶菌酶活性 用染料艳红K－2BP标记的M.Lysodeikticus为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物） 反应后离心除去未分解底物，上清液比色，吸收度为溶菌酶活力的函数。 * 溶菌酶效价测定－比色法 * 四、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase） 由动物红细胞制得的金属酶，能催化超氧阴离子转化成过氧化氢和氧。 来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量32000左右。 SOD对热较稳定，在pH5.3~9.5范围内对酶活性影响不大。 牛红细胞SOD PI为4.95。 * 效价测定 SOD测定方法： 间接法：使用氧自由基指示清除剂， SOD与指示清除剂竞争O2- ，从而抑制指示清除剂与O2- 的结合，根据指示清除剂与O2- 反应速度的变化可间接测定SOD的活性。 间接法包括：黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法和邻苯三酚法。 * 黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法 原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生O2- ，氧化型细胞色素C被O2- 还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素C在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性。 * 方法 * 注意点 在特定条件下，25 ℃（pH7.8）每分钟抑制细胞色素C还原速率达50％所需