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胡萝卜愈伤组织培养试验及改进【摘 要】在高中生物教学中，胡萝卜愈伤组织培养试验是一项重要的试验教学，对胡萝卜愈伤组织培养试验进行研究和改进十分有必要。因此，本文对胡萝卜愈伤组织培养试验进行探讨和分析，希望为相关人士提供有价值的参考，促进胡萝卜愈伤组织培养试验的不断进步，不断完善。【关键词】胡萝卜；愈伤组织培养；试验1.植物组织培养研究及与高中生物学科的联系在生物学科重新进入高考以来，与植物组织培养息息相关的知识点如：细胞全能性、植物的激素调节、及植物组织培养技术历年来都被列入高考大纲和考试说明，故在高中建立组培实验室并开展组培实验能为现阶段高中生物教学，尤其是实验教学提供第一手的可靠数据资料，对现阶段高中生物教研来说是十分必要的。1.1植物组织培养的定义植物组织培养是指在无菌的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。其完整过程是：2.胡萝卜组织培养技术2.1胡萝卜组织培养实验流程MS母液配制→培养基配制及灭菌→愈伤组织诱导→遇上组织继代培养→观察记录2.2胡箩卜组织培养实验用品新鲜的胡箩卜茎段，超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、电热炉、恒温箱、pH值测试器、紫光灯、镊子、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、滤纸、吸水纸、封口膜、MS固体培养基、Na2S2O3、1mol/LNaOH、2mg/L2，4-D溶液，1mg/L6-BA溶液、0.5mg/ml NAA溶液、15%盐酸、3%次氯酸钠、无水乙醇、0.1%升汞、蒸馏水。2.3胡箩卜组织培养实验准备工作2.3.1母液配制MS母液培养基配制：去植物组织培养MS固体培养基并加蒸馏水稀释配置母液植物激素配置：2，4-D：2mg/L、6-BA：1mg/L注：2，4-D和NAA可先用酒精溶解在加蒸馏水定容，6-BA用浓盐酸溶解后加蒸馏水定容。2.3.2诱导培养基配制和灭菌MS基础培养基+0.1mg 6-BA+2mg 2，4-D配制体积500ml，分装为12瓶取蒸馏水加入规定量的母液，植物生长调节物质和Na2S2O3，定容并检测pH值并调节pH值为5.0左右。注：在课本中要求的pH值为5.8―6.0，但是在具体的实验过程中发现当pH值在该数值左右时外植体的褐话现象较为严重，故将pH值调低至4.5-5.0。培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌后培养基在黑暗中放置3――5天观察是否有微生物污染。2.3.3其他所需灭菌物品：培养皿，三角烧瓶，若干滤纸，无菌水，若干吸水纸，解剖刀柄，剪刀，镊子等。2.4胡箩卜组织培养方法①用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的、工具、培养基等准备好放入工作台。打开紫外灯和风机至少20分钟后开始操作。关闭紫外灯，点燃酒精灯。②取胡箩卜一只，冲洗20分钟，切取形成层部分约1cm3的块状，操作者手应用酒精消毒，在无菌操作台上将胡箩卜段用酒精溶液消毒30秒，并立即用无菌水清洗2至3次，在用氯化汞溶液处理10――15分钟，并立即用无菌水反复清洗2至3次。③取一无菌培养基三角瓶：将消毒后的胡箩卜组织放入三角瓶中，每瓶3―5个，接10瓶，用封口膜封口，并用记号笔写上接种日期。④接种后的三角瓶置于培养室，20――25℃条件下，黑暗培养2-3周，直至愈伤组织形成。2.4.1外植体褐变：在具体的实验过程中发现外植体的褐变现象较为严重，造成外植体死亡。其原因是由于在切割外植体时切割部位的细胞受伤使得植物体内处于分离状态的酚类化合物与多酚氧化酶相遇，酚类化合物在多酚氧化酶的作用下形成醌类化合物和水，导致植物体其他酶系统失活，进而导致代谢系统紊乱，最终死亡。为了解决这一问题，在实验中，我们尽量选取了幼年的植物，并在培养基中添加了抗氧化剂Na2S2O3作为防褐剂。同时，在酸性和低温环境不利于醌类化合物的产生，故将pH值调低至4.5―5.0，温度调低至20oC。另外光照环境也有利于醌类物质的形成，故将接种后的培养基置于无光条件下培养。注意事项：1.所有的组织培养实验操作都必须在无菌条件下进行，所以我们必须时时注意实验材料的无菌和消毒，实验用具必须经过严格的灭菌，在灭菌的时候要特别注意必需等到烧热的实验仪器冷却后再接触材料，否则会把材料“烫伤”，所有的转移材料的操作必须在无菌操作台上进行。2.接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。同时要注意接种时瓶口应倾斜45度并在酒精灯火焰附近，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。3.培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；当灭菌完成后，应切断电源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，取出培养基。4.配制培养基时，要按照规定的用量认真计算并严格取出相应的母液