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第四次实验神经元功能定位的NOS技术 实验内容 神经元功能定位的一氧化氮合酶法（NOS法）的基本原理及其应用 NOS法的操作过程与结果判读 神经组织细胞培养技术 撰写实验报告 小结 NADPH-d组化法操作步骤 PBS缓冲液终止显色反应 要全面了解神经系统，常需要将功能和形态研究相结合。常用的方法包括： 脱氧葡萄糖法 c-fos法 细胞色素氧化酶法 一氧化氮合酶法 一氧化氮合酶(nitrfic oxides synthase，NOS) ：催化前体物质L精氨酸生成L瓜氨酸和一氧化氮(NO)；NO是一种神经递质、细胞间信使和内皮源性松弛血管的物质 NO极不稳定。易于扩散游离，半衰期短，不易检测。因NOS是合成NO的关键酶，故通常通过检测NOS的活性来评估NO的分布和功能 NOS：神经型nNOS、内皮型eNOS和诱导型iNOS 由于还原型辅酶Ⅱ—黄递酶(NADPH-d)与NOS在化学结构和组织定位上有极高的一致性，且也与NO生成密切相关．故人们常采用NADPH-黄递酶法来显示NOS活性 在神经系统中，NO作为一种细胞间的信使和神经递质，参与多种形式的突触传递： （l）介导谷氨酸的传递，扩大兴奋作用 （2）支配胃肠道及盆腔脏器的运动 （3）参与痛觉、嗅觉、视觉等感觉的传递 （4）参与神经内分泌功能调节 （5）参与神经发育和突触的可塑性：在LTP过程中作为逆信使，增强突触前膜神经递质的释放；小脑LTD是小脑进行运动、学习的机理，NO对于诱发LTD是必需的。 NADPH-d组化法原理 NADPH和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)与固定后的脑切片一起孵育，NADPH-d阳性神经元可把NBT还原为不可溶的深蓝色反应产物甲暨 。 NADPH-d组化法的优点 1、操作简单 2、NADPH-d组化法和不同的神经递质及神经活性物质的免疫组织化学法可联合应用，标记共存神经元。 3、NADPH-d标记可以呈现Golgi样的完整神经元形态 显色液：需新鲜配置 0.1M PB(pH 7.3) 0.1%还原型NADPH 0.01%NBT 0.03%Triton-X 100 操作步骤： PBS缓冲液终止显色反应 下丘脑室旁核NADPH-d 下丘脑室旁核NADPH-d 阳性神经（正常 ） 阳性神经（缺氧） 三、 神经组织细胞培养 历史与现状 1907年 Ross Graville Harrison ——体外培养基（凝结淋巴）中培养出神经元 M.T. Burrows Alexis Carrel (Carrel flask) ——培养基质改进及无菌技术引入 W.H. Lewis M. R. Lewis ——合成培养基 Honor Fell： －organ culture 应用与优缺点 应用：研究各种理化因素(如激素、生长因子、药物、毒物、温度等)对活细胞的直接影响；与多种方法的联合应用，可研究特定因素对细胞增殖、分化、代谢、运动、分泌等的影响，并探讨其调控的内在机制。 优点：具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观察结果等优点，为研究神经系统结构与功能的有效手段。在神经药理学实验中避免了血脑屏障、代谢等因素的干扰。 缺点：培养组织与细胞与在体环境仍存在相当差异，在观察与解释结果时必须牢记的。 神经组织细胞的培养与存活 取材部位与动物的年龄 胚胎或新生动物的神经组织，部位多取材于CNS的灰质组织或周围神经系统(PNS)的神经节。 大脑皮层神经细胞在小鼠一般以胚胎16－21天较好，大鼠为胚胎19天左右；小脑神经元的培养大都取自临产或新生动物。 脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎。鸡胚常用胚龄6-8d 新生大鼠大脑皮质神经元培养简要操作步骤 (1)无菌条件下取新生大鼠大脑皮质，剥除脑膜后剪成小块； (2)用平衡盐液370C水浴约10分钟； (3) 加0.125％胰酶溶液，370C水浴20-30分钟； (4) 吸去胰酶溶液，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液洗2-次； (5)加适量含胎牛血清的完全培养液，以细口径吸管反复轻轻抽吸直至形成均匀的细胞悬液； (6)对细胞悬液进行计数并调整至所需密度； (7)加约100微升于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上(集中于玻片)，盖片于六孔板中；或种植于经多聚赖氨酸处理的瓶皿； (8) 约两天后换液，培养神经元的换液时常每次换1/2，并根据实验需要适时加入有丝分裂抑制剂。 严格无菌操作； 尽量减轻对神经元损伤 使用支持介质，并在种植后进行2-4小时预贴壁 培养2-3d后，用阿糖胞苷或5-FU抑制神经胶质细胞的增殖。 多数情况下以较高细胞密度（≧106）接种，进行电生理等实验用5×105或