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体细胞核移植技术的研究进展 　　[摘要]体细胞核移植这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，他的成功表明动物体细胞的分化是可逆的。然而体细胞核移植的基础理论以及技术研究目前还有很多薄弱点，存在着克隆成功率较低等问题，在一定程度上限制了它的发展。本研究根据近年体细胞核移植技术的研究情况，对应用这项技术进行克隆的主要步骤、该技术在生物学、医学等领域的应用前景以及目前仍需克服的一些问题作一综述。 　　[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构 　　[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04 　　一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和精子相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。 　　1体细胞核移植的主要方法 　　具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。 　　1.1受体细胞的选择 　　在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中MⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与DNA螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。 　　1.2受体细胞去核的方法 　　先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条