蛋白质组学实验.ppt

　　7cm 胶条等电聚焦程序 　　 水化 12h（17-20℃） 主动水化 　　 S1 250V 慢速 2 h 除盐 　　 S2 500V 慢速 1 h 除盐 　　 S3 1000V 快速 1 h 除盐 　　 S4 4000V 线性 3 h 升压 　　 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 　　 S6 500V 快速 任意时间 保持 植物蛋白质组学实验 范海延 教授 Email:hyfan74@163.com 1 2 3 蛋白质组学简介 蛋白质组学研究的技术路线 双向电泳实验 目 录 PROTEOME：PROTEin与genOME的杂合 蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它是功能基因组学的 “中流砥柱”，是联系基因组序列与细胞功能的重要学科。 Proteome包括了一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。 ? 一门交叉学科 物理学 数学 化学 计算机科学 生物信息学 基因组 转录组 蛋白组 蛋白质组学的概念 1.植物蛋白质组学简介 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和质谱技术 被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。 2.技术路线和研究技术 蛋白质组学的研究技术 生物学问题的提出 实验模型 的设计 实验组和对照组 样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 感兴趣 蛋白点 的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 鉴定差异蛋白质 其它实验的进一步验证 蛋白信息的初步获得 蛋白质的功能 蛋白质的表达 亚细胞定位 相互作用 技术路线 ? ExPASy (Expert Protein Analysis System) 数据库/tools/几乎涵盖了所有蛋白质组学分析工具。如： ProtParam(/tools/protparam.html)软件能检索蛋白质序列理化参数 PredictProtein（/）蛋白质序列和结构预测服务网站 ? KEGG数据库（ http://www.genome.jp/kegg）全球影响力最大的代谢数据库之一 生物信息学分析 2.技术路线和研究技术 3. 双向电泳实验 细胞破碎 蛋白沉淀 蛋白溶解 去除杂质 防止蛋白水解 样品制备 第一向电泳 IEF等电聚焦 第二向电泳SDS染色 定量 平衡 选择胶条 IPG胶条 重泡胀 电泳 选择凝胶 灌胶 将IEF胶条 移至第二向 电泳 图像分析 图像采集 斑点检测 背景消减 凝胶匹配 数据分析 2-DE 实验基本步骤 样品制备 3. 双向电泳实验 TCA/acetone法 取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5mL含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20℃冰箱过夜。之后4℃下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用含0.2%的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20℃冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。 ? 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。 ? PEG 分级沉淀法：由于PEG分子在溶液中可形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，使蛋白质分子凝集、沉淀。蛋白质的分子量越大，将蛋白沉淀所需的PEG浓度越小；PEG的分子量越高，沉淀蛋白所需的浓度越低。 样品制备 3. 双向电泳实验 3.双向电泳实验 聚乙二醇（PEG）分级沉淀法 取黄瓜叶片2 g，液氮冷冻研磨，加入10 mL预冷的Mg／NP-40蛋白质提取液，混匀，4 ℃下13000 g 离心15 min，弃沉淀，上清液加入预冷的50 % (w/v) PEG储