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实验二 原代培养 一、原理 所谓原代培养就是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。理论上讲，机体所有细胞组织都可以离体培养，但是取材机体越年幼细胞生存效果越好，所以我们选用胎鼠或新生鼠 。 二、仪器、用品与试剂 仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠 试剂：DMEM培养基（含10%小牛血清），0.25%胰酶 三、操作步骤 （一）胰酶消化法 1、取材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2～3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内），解剖取大脑皮层（或肝脏等），置平皿中。 2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3、用手术剪将大脑皮层（或肝脏等）剪成小块（1mm3），转移至离心管中。 4、视组织块量加入5～6倍的0.25%胰酶液，室温消化5分钟，用吸管吹打，使细胞分离。 5、加入3～5ml完全培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。 7、加入完全培养液 3～5ml，转移至细胞培养瓶中，37℃，5% CO2条件下培养。 上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。 （二）组织块直接培养法 自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。37℃静置3～5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 四、注意事项 1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 * * *
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