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小麦K型不育系育性恢复基因的cDNA-AFLP分析 答辩 人：吴博 班级:农学专升本12-2 导师：詹克慧 内容提要 一 研究背景 小麦是我国第三大粮食作物，随着全球人口剧增，人类对小麦的需求量也呈增长趋势。因此，培育高产小麦新品种已经成为当前小麦育种的迫切要求。杂种优势的利用能大幅度地提高小麦单产水平，充分发掘小麦产量的遗传潜力,是未来小麦单产瓶颈突破的重要方法，经过数十年的不断探索，目前已形成了多途径利用小麦杂种优势的现状，在理论和技术方面取得了较大的研究进展。 目前小麦杂种优势利用的主要途径 二 目的与意义 利用cDNA—AFLP技术,对小麦K型不育系豫麦3号及其相应的保持系，以及两个恢复基因近等基因系在小麦二核花粉时期的基因表达谱进行分析，从而对育性恢复在细胞信号的转导、传递、基因转录与调控的分子机制方面进行预测。 三 实验材料 恢复系两个近等基因系NILR-1和NILR-2、保持系豫麦3号、不育系K豫麦3号。 四 试验方法 五 结果与分析 1. 利用120对P/M引物组合研究了不育系、保持系和恢复基因近等基因系在二核花粉时期的基因表达变化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共观测到10 757条清晰条带。22对引物能够在近等基因系NILR-1、NILR-2和不育系豫麦3号及其保持系之间扩增出53条差异条带 。 结果与分析 1.NILR-1；2.NILR-2；3.豫麦3号；4.K豫麦3号 1.NILR-1；2.NILR-2；3.Yumai 3；4. K-type sterile line Yumai 3 图1 近等基因系、不育系和保持系的cDNA-AFLP的电泳结果 Fig.1 Amplified product of NIL lines、sterile lines and maintainer lines 结果与分析 M.Marker(DL2000);N.阴性对照;1~28.部分差异TDFs回收后二次PCR. M.Marker(DL2000);N.negative control;1~28.parts of 2nd PCR of difference TDFs. 图2 部分差异TDFs回收后二次PCR的电泳结果. Fig.2 2nd PCR of parts of difference TDFs. 结果与分析 2. 将回收纯化成功的35条特异性片段进行测序 ，通过Blast检索表明，与已知基因有同源性的片段有23条，编码未知功能蛋白的片段有3条，另有9条片段与已知基因或序列无任何同源性，可能是尚未发现的新基因。 35个TDFs中有25个只出现在近等基因系中出现，有10个只在保持系和不育系中出现，有1个在所有材料中都出现但在近等基因系中表达量高。表明小麦K型不育的育性恢复过程中既受恢复基因的控制，也受抑制基因和其他微效的调控影响。 结果与分析 3. 在35个能通过BLAST方法确定具体功能的差异TDFs中，包含有转录因子、胁迫响应、细胞和组织代谢、转录促进、表达调节、混合功能、未知功能以及无同源性等类型。表明小麦K型不育的育性恢复过程需要各种类型的酶系参与，育性恢复的机理包括复杂的信号通路和生理生化代谢途径。 六 结论与讨论 1. 本研究表明，小麦K型不育系育性恢复基因的遗传机理是一个综合的、受多种生理生化过程调节的复杂过程。 2. 此研究结果也表明cDNA-AFLP技术在目的基因研究上的可用性。 结论与讨论 3. 关于小麦K型不育系花药育性发育的生理生化机制前 人已经进行了广泛研究。其中，在本实验中分别得到了两个与花药组织中IAA和脯氨酸含量密切相关的差异表达片段P1M3-1和P1M3-3，其序列分别为吲哚乙酸氨基化合成酶和脯氨酰-tRNA合成酶, 都能在花药发育以及育性转换方面起到重要作用，这也表明小麦K型不育系育性恢复基因与花药育性的生理生化过程有着密切联系，为今后深入研究二者之间的关系提供了线索。 请老师批评指正 谢谢！