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引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务） 四、PCR反应特点 第二节 逆转录PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR） 三、逆转录病毒合成cDNA的基本过程 将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。 3.自动测序法。 Sanger 电泳检测--310 电泳检测--3100 步骤１：毛细管灌胶 步骤２：样品盘移动 步骤３：电进样及电泳 步骤４：荧光激发及检测 补充：测序及连接方法的遴选 对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun)：即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基序列进行拼接，由Celera提出。 步骤： 取全基因组DNA → 纯化酶切或超声波打断 → 电泳 → 回收DNA片段 → 构建质粒文库 → 转化宿主菌 → 扩增培养 → 提质粒DNA为模板进行PCR测序 → 上测序仪 → 处理测序数据 → 补缺 → 完整基因组序列。 shutgun法 2. 层次散弹（hierarchical shutgun） 第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序，这样使最后“拼接”变得容易得多。 一、 Sanger 双脱氧链终止法 （一）原理(单链) DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2`，3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH， 不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。 双脱氧核苷三磷酸 互补链合成过程 以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3′-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；②能以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸。 如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′ 3′外切核酸酶活性）、其中一管中分别加入1种 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP）以及4种dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP ），引物末端用放射性核素标记， ddTTP的比例很小（1:10），因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度的DNA片段合成。它们都具有相同的5′末端，3′末端都因掺入了ddTTP而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的ddNTP。 Sanger双脱氧测序方法示意图 双脱氧法测序原理示意图 （1）鸟枪法 将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶I法和限制酶切割法。 （2）嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base） ①首先将大片段克隆到测序载体； ②选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将DNA切断,使切割后近载体端为3`突出的粘性末端，近待测DNA的末端为5`