狐辅助生殖技术研究进展.ppt

辅助生殖技术在犬科动物上的应用 2011﹑3﹑28 犬科动物中狗的辅助生殖技术始于18世纪。第一次人工受精是意大利人Spahamani，出生三只小狗。之后，这一领域进步非常慢，冷冻精液人工受精产仔首次报道于1969年。狐的人工受精始于20世纪80年代Scandinavia，产生了银狐和蓝狐的杂交狐。由于犬科动物雌性特殊的生殖生理特点，其它的人工繁殖技术进步的非常慢，最近几年，一些基础研究比如卵母细胞成熟，体外受精，胚胎移植才开始逐渐研究。 卵母细胞成熟 卵母细胞生成和成熟过程 卵子生成始于胚胎期的原生殖细胞，之后从胚外中胚层迁移到后肠后部内胚层，到达生殖嵴后，与周围的体细胞建立密切的联系，发育为卵原细胞，随着一系列有丝分裂过程，大部分卵原细胞分化为初级卵母细胞，并进入第一次减数分裂前期，之后是粗线期，双线期，分娩时，双线期的卵母细胞在生长和分化过程中不断的进行物质积累及细胞周期调控蛋白的翻译和翻译后修饰作用（de Vantery et al., 1997），在不同动物，卵母细胞在这一时期休止数日至数年不等，卵泡不断生长，但卵母细胞仍处于GV期，一直到性成熟前。性成熟后，在体内排卵前促性腺激素峰的作用下开始恢复减数分裂。 狐季节性单次发情动物，每年的1-3月，发情季节开始排卵前LH峰后1-2天排卵，排卵前卵泡发生黄体化，孕酮增加，雌二醇含量增加。大部分哺乳动物，排卵时卵母细胞处于第二次减数分裂中期。犬科动物，排卵时卵母细胞处于第一次减数分裂，排卵时刚发生GVBD.卵母细胞在输卵管中成熟。（Holst and Phemister, 1971; Farstad et al., 1989）.. 排卵时，卵母细胞周围的卵丘细胞团紧密，且成多层排列，卵胞质由于高含量的脂质颜色非常黑。卵母细胞成熟时，卵丘扩展，但是，直到桑葚胚的狗胚胎还附着着卵丘细胞，对于狐而言，体内LH峰后的2-3天，核成熟完成时，卵丘扩展完全，呈放射状排列。目前,尽管国内外有一些犬科动物卵母细胞体外成熟培养和克隆犬的实验报道,但成功率很低，主要原因是对犬的生殖内分泌学及其卵母细胞成熟所需的条件与因子缺乏足够的了解。 犬科动物卵母细胞使用牛和猪的体外成熟技术，能够自发恢复减数分裂，但是成熟率很低。成熟率在0%-58%. (MI/AI/MII).到达MⅡ期的比例只有20%,对于狐来说，排卵前卵泡卵母细胞或者是间情期卵泡得到的卵母细胞体外成熟，成熟率与其它犬科动物得到的成熟率相似（80% — 100 GVBD, 25% MII）.（Krogen?s et al., 1993; Wen et al., 1994.），近年来，间情期蓝狐卵母细胞到达MⅡ期的比例有所升高，达到40%（Srsen et al., 1998）。 犬科动物卵母细胞体外成熟 目前来说，犬科动物卵母细胞体外成熟率在0-58%（通常是20%）。成熟率低的原因在于 卵母细胞本身的质量差，卵丘细胞不完整，卵胞质中空，透明带破裂，卵母细胞直径小， 体外培养激素环境不恰当 卵丘细胞扩展，卵丘细胞和卵母细胞关系在犬科动物卵母细胞体外成熟中的作用还没有深入的研究。 体外培养血清和蛋白补充对卵母细胞体外成熟的影响 受精和胚胎发育 精子的体外获能 Modilied Tyrode’s medium (i.e., Sperm-TALP), commonly used for in vitro capacitation of bovine spermatozoa, has been used as a capacitation.medium both for dog and fox semen in vitro。 胚胎体外发育 犬科动物体外成熟和体内成熟卵母细胞受精后已经产生胚胎（Renton et al., 1991; Farstad et al., 1993a）首次报道狗受精卵体外发育到桑葚胚期是在1991年，体外成熟，体外受精的受精卵发育到8-细胞期，就发生阻滞（Yamada et al.,1993; Metcalfe, 1999.）. 各种动物胚胎体外发育都会发生阻滞现象，体外发育阻滞时期时母源基因组向胚胎基因组过度时期，即胚胎基因组激活时期，经研究发现，狐胚胎基因组激活时期是6-8细胞期（Farstad et al., 1993b; Bysted and Greve, 2000）。 很少有报道，改善8-细胞后犬科动物胚胎发育的培养液，目前为止，还没有体内成熟或者体外成熟的狗和狐卵母细胞体外受精后产生后代的报道。ICSI在狗卵母细胞上的研究，只有比例很小的卵母细胞（7.8%）形成了雄原核，还没有卵裂胚的报道。Farstad et al报道体内成熟的狐卵母细胞经体外受精得到的受精卵卵裂，最终发育到16