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质粒DNA的提取、纯化与鉴定 一、基因克隆的质粒载体 1、定义 双链闭环DNA； 1kb--200kb； 独立存在于宿主染色体之外； 具复制起始点； 复制和转录不同程度依赖于宿主基因； 编码某些酶，使宿主具有特殊标志， 可供选择。 2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。 3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 λ噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体 4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5α、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等 二、质粒DNA的分离纯化 （一）、细菌培养物的生长和收获 （二）、质粒DNA的提取 1、碱裂解法小量制备质粒DNA: a、细菌的收集； b、加入100цl溶液Ⅰ，重悬细菌； c、加入200цl溶液Ⅱ，使细菌悬液清亮； d、加入150цl溶液Ⅲ，冰上放置3-5分钟； e、加入450цl酚：氯仿混匀； f、12000rpm，离心5分钟； g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温 静置2分钟； h、12000rpm离心5分钟，弃上清； i、75%乙醇洗涤，室温晾干； j、溶于适量TE/R中。 三、质粒DNA的鉴定 （一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。 （二）、EB荧光分析 （三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。 * * 南通大学江苏省神经再生重点实验室 蒋茂荣
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