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高分子杂质的检查 四川大学华西医学中心 TGR 2007.3 检查高分子杂质的意义 　β－内酰胺抗生素是临床上常用的药物之一。同时也是较易发生不良反应的药物之一。在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。引发β－内酰胺抗生素速发型过敏反应的过敏原并不是β－内酰胺抗生素本身,而是其中存在的高分子聚合物。在六、七十年代就报道β－内酰胺类抗生素溶液在室温下放置几天产生聚合物,其具有强的抗原性质,在临床过敏反应中起重要作用。经近几十年的研究也证明抗生素所致的过敏反应抗生素是由其中存在的高分子聚合物产生的 高分子杂质的含义及分类 1.含义：高分子杂质：高分子杂质是对药品中分子量大于药物本身的杂质总称。它可能是聚合度不同的多组分混合体。 2.分类：抗生素药物中的高分子杂质按其来源通常分为外源性杂质和内源性杂质: （1）外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质,或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物,外源性杂质一般来源于发酵工艺; （2）内源性杂质系指抗生素药物自身聚合产物,聚合物可来自生产过程,又可在储存中形成,甚至在用药时也可由使用不当产生。 三种主要分离模式 抗生素聚合物的免疫原性通常较弱,但作为多价半抗原,可引发速发型过敏反应。因此需要控制其含量。 近几十年来国内外对β－内酰胺抗生素中高分子聚合物的分离分析研究报道有许多,概括起来其分离的方法主要是色谱法,分离模式主要有三类: ①凝胶过滤色谱法; ②离子交换色谱法; ③反相色谱法。 一.凝胶过滤色谱法 凝胶过滤色谱法主要利用分子排阻的原理,即分子量差异进行分离的色谱模式。这对于分离药物中的高分子聚合物是一种简便易行的分离模式。在分离分析高分子聚合物的报道中,此类分离模式也是占主要部分。 凝胶色谱法原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 色谱柱 在早期的报道中,运用凝胶色谱分离高聚物的色谱柱填料主要采用葡聚糖凝Sephadex G－25。但后来报道中指出了Sephadex G－25 对一些青霉素类药物(如PL－385)有强吸附作用,青霉噻唑酸的峰出现在聚合物峰的区域,氨基(amide) 共价体二聚物与青霉噻唑酸有相同的Kav 值,因此可干扰测定。 Kav即有效分配系数：表示分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。 Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关： Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。 后来又有人使用Sephadex LH－60 ，虽然对PL－385 无吸附作用，但因Sephadex LH－60 分离度低,因此也不用于分离聚合物。 总之，以上报道的分离、分析方法因操作繁琐,实验误差大等原因,难于满足质量控制的需要。 因此，近期的报道中主要采用葡聚糖凝胶SephadexG－10 填料,其分子排阻量为700 道尔顿(葡聚糖) 。 Sephadex G-10 葡聚糖凝胶分子结构 Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为2~10。 但酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex 与强酸和氧化剂接触。 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 胡昌勤等运用葡聚糖凝胶Sephadex G－10 分离分析β－内酰胺抗生素中的高聚物