基因工程技术对人类的影响.docVIP

浅谈基因工程在医学上的应用 摘要:近年来随着生物工程技术的发展许多基因工程陆续问世本文详细介绍了基因工程的研究进展概述了基因工[1] 一、基因工程的兴起基因工程的兴起，是二十世纪科学技术最具革命性的成就之一，开创了人类认识自然、改造自然的新纪元。1996年诺贝尔奖获得者、莱斯大学的化学家罗伯特?柯尔说：“本世纪是物理学和化学的世纪，但下个世纪显然将是生物学的世纪。”随着“人类基因组计划”的初步完成，及其基因工程操作技术的不断完善，人类在基因领域已经取得了巨大的进步，基因工程技术正在以令人目不暇接的速度和不可思议的方式改变着这个世界，已经或即将对人类社会产生重大影响。[] 基因工程在其产生的短短30多年时间，已经发展到了相当成熟的地步。其应用范围之广、应用领域之多，已渗入到社会生活的方方面面。医疗领域利用基因工程技术生产临床治疗中非常有价值的活性多肽，不仅解决了来源困难的问题，降低了生产成本，而且可以利用在体外操作基因的优点，制造出更有效、副作用更少的药品乙肝病毒疫苗，肺结核疫苗，毒疫苗白细胞介素干扰素 [5] 基因工程菌的制备 目的基因的分离 克隆载体 目的基因与克隆载体的体外重组→ 重组体导入大肠杆菌K12→受体菌的培养及筛选→从受体菌中获取目的基因 表达载体 重组质粒(导入大肠杆菌)→ 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测→工程菌 (一)、目的基因的分离 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内或5‘-端最好有内切酶酶切位点。 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA。 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA。 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物。 (二)、目的基因与克隆载体进行体外重组 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接 2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后（无义突变也行），导入受体细胞，筛选 (三)、重组体引入宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。 (四)、从大肠杆菌k12获取目的基因 由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。 步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。 (五)、提取重组质粒 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制。 2、细菌的收获和裂解用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。 (六)、质粒DNA的纯化 利用聚乙二醇沉淀法提取质粒ＤＮＡ (七)、对重组质粒的检测与目的基因提取 对获得的质粒进行双酶切，获得目的基因与PBR322质粒片段，通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因与PBR322质粒片段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通过与已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着利用Qiagen纯化柱回收纯化DNA。具体：用3倍体积的特殊高盐溶液于55°融化带有目的基因的DNA片段的琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱，经过如图结合—洗涤—洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。 (八)、目的基因与表达载体的组合与导入 表达载体：PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理，退火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析质粒稳定性。 第二步: 干扰素的生产工艺: 1．菌种制备 取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，