摘要；本研究主要目的是测定奶牛处于热应激生理状态下，对其体外胚胎.docVIP

30热应激奶牛体外胚胎发育的研究 丁丽艳1 何宝国2 王洪宝1 韩永胜1 李同豹1 佟桂芝1 （1 黑龙江省畜牧研究所 161005 ，2 齐齐哈尔医学院 161042） 摘要：本论文主要研究目的是处于热应激生理状态下的奶牛，其卵母细胞体外成熟、受精及发育有何影响。试验选择12头干奶期或接近干奶期荷斯坦奶牛，处于夏季热应激状态下，没有任何降温设施，自由饮水。经FSH超排后，利用活体采卵技术，采集卵母细胞。其中2头超排无反应，10头奶牛共采集卵母细胞1169枚，可用623枚，可用率为53.29%。试验设对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。对照组培养温度为38.5℃，CO2%为5%，饱和湿度；试验Ⅰ组卵母细胞成熟和受精过程予以试验条件(培养温度模拟热应激奶牛直肠24h波动温度，同时CO2%也随之调整，以保持溶液PH值在7.4左右，调整过程中O2%不变，通过调整N2%来达到气体平衡，饱和湿度。)，以后则改为正常培养条件（温度为38.5℃，CO2%为5%，饱和湿度）；试验Ⅱ组则整个试验过程都为试验条件。试验结果：对照组卵母细胞成熟率为75.64%（155/205），受精率为52.89%（82/155），囊胚发育率为33.7%（28/82），相对于试验Ⅰ组卵母细胞成熟率为68.10%（143/210），受精率为 40.56%（58/143），囊胚发育率为22.41%（13/58）差异不显著(p0.05)；相对于试验Ⅱ组卵母细胞成熟率为65.87%（137/208），受精率为40.88%（56/137）差异不显著(p0.05)，囊胚发育率为7.14%（4/56）差异显著(p0.05)。 关键词：热应激 奶牛 体外受精 囊胚率 1 试验材料与方法 1.1 试验奶牛 黑龙江省畜牧研究所试验牧场引进的加拿大荷斯坦奶牛。 1.2 试验药品 FSH（加拿大生产）；其它试剂（TCM-199液、Hepes-TALP液、IVF-TALP液、CR1aa液等）为SIGMA公司生产；FCS为生物制药厂生产。 1.3 试验方法 1.3.1 测试热应激奶牛直肠温度 夏季高温天气情况下，奶牛放在露天运动场，自由采食、自由饮水，无任何降温设施。使用水银温度计来测量奶牛直肠温度。在1d时间内(从头一天早晨7:00至第二天早晨6:00)，每隔1h测一次直肠温度、空气温度和地面温度（每一点的数值是连续测量一周的平均值）。 1.3.2 体外胚胎生产 将试验奶牛用FSH进行超排后，利用活体采卵技术[6]，采集卵母细胞（采集情况见表1）。经过实验室处理后[5]，将卵母细胞复合体培养在覆盖有矿物油的、预先放入CO2培养箱中平衡2小时的卵母细胞培养液（TCM-199）中（50μl/微滴，20－25个/微滴）。每组（对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组）培养10滴，培养24h。将成熟的卵丘细胞复合体用Hepes-TALP液清洗，然后放进预先制备好（覆盖矿物油后放入CO2培养箱中平衡2小时）的IVF-TALP液滴（600μl/滴）中。 用梯度离心法洗净的精子放进成熟卵母细胞中（密度为1×106个精子/滴），培养24h，然后将合子培养在CR1aa液中。受精后第5d在培养滴中加入5μl FCS，培养第8天测定发育囊胚数。 1.3.3 培养温度与CO2%确定 胚胎培养温度与热应激奶牛直肠温度相似，CO2%随着培养温度变化而变化。正常培养条件时， 38.5℃下CO2为5%。当在高温下培养时，CO2%调整为：39.5℃下5.5%、40.5℃下6.5%[2,3]。 1.3.4 统计分析方法 分析试验数据采用最小二乘法利用SAS软件进行分析。 2 结果与分析 2.1 奶牛直肠温度、地面温度、空气温度及胚胎培养温度 奶牛虽然是恒温动物，但随着外界温度变化，体温也随着变化，只是变化幅度较小。奶牛直肠温度即为体温，也代表子宫的温度，即正常温度下子宫内的胚胎也要承受此变化温度的刺激，所以模拟这一变化温度进行体外胚胎培养（见图1-1）。 2.2 卵母细胞采集结果 总共超排12头荷斯坦奶牛，有2头没有反应，这可能由于热应激引起。在发情后第7天采集卵母细胞，此时期采集效果好于其它发情时期[6]。本试验卵母细胞可用率为53.29%，低于60.5%[6]，这可能由于热应激导致的结果，有的卵母细胞发育较小，或已经停止发育（见表1）。 表1 奶牛活体采集卵母细胞情况表 超排头数 采集头数 卵母细胞 总 数 平均获卵母 细胞数 可 用 卵 母 细胞数（率） 平均获可用卵 母细胞数（率） 12 10 1169 97.42 623(53.29%) 51.92(53.29%) 2.3 胚胎发育结果 对照组卵母细胞成熟