DNA分子标记的种类课件.ppt

SRAP的技术流程 1.引物的选择 大小 ：17~18bp 上游引物：在5’端前10个是填充序列，接着是CCGG，3’端是3个选择碱基。 下游引物:在5’端前11个是填充序列，接着是AATT，3’端是3个选择碱基。 引物的设计原则： ·它们不能形成发夹结构或其他耳机结构 ·G、C含量在40~50% ·上游和下游的填充序列长度在10或11个碱基，二者必须不同 2.DNA扩增 模板：基因组DNA或者cDNA 方法：复性变温法 扩增程序： 3.凝胶电泳以及扩增产物检测 1.2.6双脱氧化指纹法 (Dideoxy Fingerprints，ddF) ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。 2.1扩增片段长度多态性(AFLP) AFLP：特点是把RFI 和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR 扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3 ‘端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3 ’端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制性片段扩增。 应用 AFLP广泛用于构建遗传连锁图谱、基因组研究、遗传育种、亲子鉴定、遗传病诊断等领域。 AFLP 产生的多态性远远超过 RFLP 和RAPD 等技术，因而被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。但该技术已申请专利， 在生产及商业上的应用受到一定的限制。 2.1 CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence) CAPS技术又可称为PCR- RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，用EB染色，观察。与RFLP 技术一样，CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测，其多态性称为ALP。Neff et at，(1998)在此基础上又发展出dCARS技术(derived CAPS)，这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。 三、第三代分子标记技术：单核苷酸多态性(SNP)技术 单核苷酸多态性是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）的突变引起多态性，它是一种单核苷酸的变异。 SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 随着计算机和DNA芯片技术引入分子生物学领域，研究者可同时对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果。常用方法：1、随即扩增DNA（RAPD）法；2、DNA芯片（DNA-chip）检测法 应用 遗传疾病研究 基因连锁和关联分析 药物基因组学 药物发现/药靶 农业/畜牧业遗传学 法医/个体识别 其它 四、其他几种分子杂交技术 1.MLPA标记 2.RGAs标记 3.SRAP标记 4.TRAP标记 1.MLPA：多重连接探针扩增技术 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。 2.RGAs 标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基因类似物) RGAs 是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子标记。尽管基因间整个序列的同源性不足于用RFL P 杂交检测,但抗病基因中存在的这些保守区域为在其它植物中进行PCR 扩增和分离RGAs 提供了机会。 3.SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism ,相关序列扩增多态性) SRAP 标记是基于PCR 技术的新型分子标记技术,其原理是利用基因外显子里G、C 含量丰