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快速康复外科联合四君子汤对急性胆道梗阻大鼠肝脏缺血―再灌注损伤时肝细胞凋亡的影响 　　DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.06.013 　　基金项目：浙江省教育厅科研项目 （Y201120554） 　　作者单位： 310006 杭州， 浙江中医药大学附属第一医院外科 　　通信作者： 傅永清，Email：fuyongqing1949@163.com 　　急性梗阻性黄疸患者手术中发生的肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury， HIRI）是导致患者术后肝功能衰竭的主要原因。HIRI发生机制复杂，目前已知与细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等有关[1]。当前，尚无防治HIRI的有效治疗措施 [2]。快速康复外科（fast-track surgery，FTS）的核心观念是利用术前、术中、术后的综合性措施减少机体应激反应，减少创伤，促进早期康复。其主要措施包括术前不禁食、禁饮，不作机械肠道准备，术中不留置引流，术后早期进食，取消不必要的胃肠减压等与以往传统习惯不同的围手术期处理方式。本研究以FTS联合中药四君子汤作为干预手段，从抗细胞凋亡的角度研究其对急性梗阻性黄疸大鼠HIRI的保护作用及机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　健康SD大鼠80只，雄性，体质量（220±40）g。随机（随机数字法）分为4组：1个对照组、3个实验组（FTS组、四君子汤组、FTS+四君子汤组），每组各20只。 　　四君子汤（人参12 g、茯苓9 g、白术9 g、炙甘草6 g）：上方水煎煮2次，合并滤液浓缩至生药质量浓度为1 g/mL；细胞凋亡检测试剂盒：美国罗氏公司。鼠抗人Bcl-2，Bax单克隆抗体：美国Santa Cmz公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 动物模型及手术方法 制备模型方法如下。每100 g体质量0.13 mL 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，距肝门0.5 cm处用4-0丝线结扎胆总管后关腹（图1）。术后第4天，第二次手术（肝脏缺血-再灌注）。开腹后，分离肝蒂，用5-0血管缝线结扎门静脉，持续缺血40 min，开放门静脉予再灌注，关腹（图2）。 　　图1 胆总管结扎 图2 门静脉结扎 　　1.2.2 分组干预方法 常规围手术期处理措施：术前禁食、禁水12 h；术前生理盐水灌肠1次；术中放置腹腔引流管；术后禁食6 h。①对照组：实施常规围手术期处理；②四君子汤组：实施常规围手术期处理，胆总管结扎后至缺血-再灌注手术前予四君子汤灌胃3 d，每次2 mL，每天1次；③FTS组：不实施常规围手术期处理（术前开放饮食、饮水，不灌肠，不放置引流管，术后不禁食）；④FTS+四君子汤组：不实施常规围手术期处理（术前、术后均不禁食，不灌肠，不放置引流管），胆总管结扎后至缺血-再灌注手术前予四君子汤灌胃3 d，每次2 mL，每天1次。 　　1.2.3 标本采集及检测 缺血-再灌注术后24 h，心脏取血，打开腹腔，剪取肝脏组织约10 g检测。 血清，检测AST、ALT水平。 TUNEL法检测肝细胞原位凋亡，操作方法按试剂盒说明进行。判断标准：以光镜下观察到胞核呈棕色或棕褐色为原位凋亡细胞。计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：光镜下随机选取5个视野，计数平均200个细胞中的阳性细胞数，以百分数表示。 采用免疫组化二步法染色检测肝细胞Bcl-2，Bax蛋白表达。阳性结果判断标准：胞浆出现黄色或棕黄色着色为表达阳性。每张切片随机选择10个高倍视野（×400），测平均光密度（OD），以平均光密度作为指标进行半定量分析。 　　1.3 统计学方法 　　计量资料用均数±标准差（x±s）表示。各组均数比较采用单因素方差分析。使用SPSS 20.0软件包，以P0.05为差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　动物总共死亡7只，病死率8.75%。其中胆总管结扎术后至缺血-再灌注手术前死亡5只（6.25%），缺血-再灌注术后死亡2只（2.5%）。 　　2.1 血清ALT、AST水平 　　3个实验组ALT及AST水平均较对照组显著降低（P0.05）。实验组之间，FTS+四君子汤组ALT水平显著低于FTS组及四君子汤组（P0.05）；FTS+四君子汤组及四君子汤组的AST水平显著低于FTS组（P0.05）。见表1。 　　2.2 肝细胞原位凋亡及凋亡指数 　　3个实验组肝细胞凋亡指数均显著低于对照组，P0.05。见表2。 　　2.3 Bcl-2、Bax蛋白表达情况 　　3个实验组Bcl-2蛋白表达均显著高于对照组，而Bax蛋白表达均显著低于对照组（P0.05）。见表3和图2。 　　A：对照组 Bax；B：对照组