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脑缺血再灌注大鼠免疫炎症反应相关研究 　　【摘 要】目的：探讨脑缺血再灌注大鼠免疫炎症反应。方法：采用线栓法闭塞大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血再灌注模型；应用苏木精-伊红染色法观察缺血侧脑组织神经元缺血坏死情况，炎症免疫反应改变，炎性细胞粘附、浸润情况。结果：免疫组化结果显示ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致；P-selectin阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致。结论：大鼠局灶性脑缺血再灌注后ICAM-1、P-selectin表达明显增加，提示它们共同参与缺血再灌注后炎症反应，引起缺血再灌注性脑损伤。 　　【关键词】脑缺血再灌注；ICAM-1；P-selectin；炎症反应 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　1.1.1实验动物：选用健康成年雄性SD大鼠，体重250～300g。 　　1.1.2主要试剂和药品：2%戊巴比妥钠-生理盐水；4%多聚甲醛-PBS；抗ICAM-1羊抗鼠抗体；免疫组化二抗试剂盒；防脱片剂。 　　1.1.3主要实验仪器：玻璃匀浆器、凝胶成像分析系统、电子天平、光学显微镜。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 动物分组 　　采用完全随机的原则，将大鼠分为四组，每组10只，分组如下：正常对照组、假手术组、模型1组、模型2组。 　　1.2.2线栓制备 　　取4-0单股尼龙丝线40mm，直径0.23mm。 　　1.2. 3大脑中动脉栓塞（MCAO）模型制作 　　参照Zea Lnoga等方法稍加改进，行右侧MCAO手术。于缺血2小时后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。整个手术过程采用体表加热/制冷将肛温控制在36.5～37. 5℃范围内，同时将环境温度控制在25～30℃左右。 　　1.2.4神经症状行为学检测 　　依据Zea longa及Bederson等确定的5级评分方法进行神经功能评分。 　　1.2.5操作方法 　　正常组：与其它各组同时期常规饲养。假手术组：大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA及ICA至PPA，不插线栓。模型组：将手术后造模成功，即神经功能评分在2～3分归入模型1组和模型2组，缺血2h后，按各组要求分别再灌注6h和24h。 　　1.2.6取材 　　各组动物在规定时间的手术观察完成后，于再灌注后各时间点以2%的戊巴比妥钠过度麻醉，迅速断头取脑，每组各取3例在冰盘上自大脑中动脉梗死区中心为起始点前后做约4mm厚的冠状切片，投入20%中性福尔马林固定液中固定，以做病理组织切片HE染色。 　　1.2.7指标检测与方法：缺血再灌注侧脑组织病理切片观察；ICAM-1、P -selectin的免疫组化染色。 　　1.2.8数据处理和统计学分析：采用SPSS（10.00版）统计软件包进行统计，所有数据采用平均数±标准差（M±SD）表示。各组组间差异采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P0.05作为具有显著性差异的标准。 　　2 结果 　　2.1局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）大鼠行为学改变 　　①静止时不能充分伸展左前爪，行走时向左侧转圈或倾倒；②动物爬板实验时，总是落向左侧；③提尾实验时，左前肢内收，头弯向左上；④出现霍纳氏征。神经功能评分在2～3分。 　　2.2脑缺血侧脑组织形态学改变 　　2.2.1大体标本观察 　　脑缺血再灌注模型组和治疗组：缺血再灌注6h见脑膜血管高度充血，冠状切面组织有肿胀；缺血再灌注24h见脑组织轻度变软，切面淡黄色灰暗，灰质与白质界限变模糊，脑室变形。正常和假手术组：脑组织无充血水肿及坏死。 　　2.2.2光镜下观察（病理组织切片HE染色） 　　（1） 低倍镜下情况：观察到模型组和治疗组大脑皮层缺血坏死区域都集中在颞叶皮质区，即MCA支配供血区。表明造模成功，MCAO手术模型恒定，缺血区域一致，为大脑中动脉供血区。 　　（2） 高倍镜下情况 　　正常组与假手术组：皮质区正常，未出现坏死灶，脑组织及血管内未见炎性细胞。局灶性脑缺血再灌注6h模型组：缺血皮质区神经元开始变性坏死，可见胞核固缩为三角形，结构及核仁消失。局灶性脑缺血再灌注24h模型组：缺血皮质区神经元溶解性坏死严重，可见大量空泡形成，血管周围也出现较多炎性细胞并形成围管现象。 　　2.3脑缺血再灌注大鼠ICAM-1和P-selectin表达情况 　　免疫组化结果显示ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致；P-selectin阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致。 　　3 讨论 　　脑缺血损伤与动物模型的选择制备本模型的优点是：缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态；由于对缺血及再通时