201012101213苏延停PCR技术课件.pptVIP

不需要拓展功能 设置循环数 后延伸保温 后延伸温度和时间 Step #3Option？ No yes Total Cycle= 35 Segment #3Hold Cycle END Hold at 72.0CHold for 10m0s Segment #4Hold Cycle END 选择反应完后保温 Hold at 4.0CHold for 99m0s 设置反应完后的保温温度和时间 Segment #5Hold Cycle END 终止参数设置 Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no 预计反应时间，程序是否保存 Lid LIDTurn off heatedLid below 9C 当温度低于9度时，热盖自动关闭 Run PCR1 PCR2 RUN PCR1Use heated lid? Yes No RUN PCR1Vessel: 0.2TUBE0.5tube plate RUN PCR1Volume(Ul) 50 K RUN PCR1Lid temperature: 19℃ 4.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。 三、操作步骤 9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 1) 基因克隆 PCR技术的应用 重组DNA 质粒DNA 基因片段 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I GTCC GGAC CCTG CAGG GTCC GGAC CCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 限制性核酸内切酶 质粒DNA 目的基因 2)基因检测 A’ A 病 人 正常人 (-) 病 人 (+) 内源性病变基因 病原微生物基因 遗传病的诊断 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 基因缺失、插入或置换等 A 正常人 病 人 正常 病人 ASO探针法 A C T G ASO探针 正常 病人 探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 3)基因配型 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 法医学分析 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测 父’ 父 子 母 现 嫌1 嫌2 嫌3 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 PCR示例 一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。 1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2 二、实验材料、仪器和试剂 1.反应体系（50μl体系）： 10 X PCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 1