23流式细胞仪检测教案.ppt

第23讲 流式细胞仪检测技术（FCM） FC500 Dual Parameter Histograms 常用荧光染料的特性 FCM的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 FCM的临床应用 FCM的科研应用 FCM的应用——肿瘤学 细胞周期分析 DNA分析的临床意义 DNA分析诊断肿瘤 DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF15% DNA倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT) 多发性骨髓瘤 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡分析 细胞凋亡分析 细胞凋亡—PI分析 细胞凋亡—Active Caspases-3 细胞凋亡—Caspases-3 细胞凋亡—Annexin V 细胞凋亡—Annexin V 细胞凋亡—BrdU FCM的应用——免疫学 FCM的免疫学应用 淋巴细胞亚群分析 临床意义 淋巴细胞亚群分析 SimulTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒 淋巴细胞双色分析 LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性 淋巴细胞双色分析 AIDS病人T细胞亚群分析 FCM的应用——血液病学 白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 FCM的应用——分子生物学 分选细胞后进行FISH 分选细胞后进行PCR 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4＋细胞中HIV特异的DNA或RNA 流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染色体端粒长度 性别选择 细胞周期分析——PI单染 细胞周期分析——PI单染 细胞周期分析——ModiFit 分析 细胞周期分析——ModiFit 分析 大鼠生精细胞分析——PI单染 细胞凋亡—PI加Annexin V双染 淋巴细胞亚群分析 培养细胞表面粘附分子表达 培养细胞表面粘附分子表达 作业： 举例流式细胞术的应用 O(∩_∩)O谢谢 细胞凋亡的主要指标 细胞内酶改变：Caspase-3活化 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 凋亡相关蛋白： Fas Bcl-2 PI - Fluorescence Events 调亡细胞 正常G0/G1期细胞 淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV的诊断与研究 淋巴细胞 CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究 HLA-B27检测 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数 了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测 根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。 CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰 ?1/?2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色 CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞 CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞 FITC-Annexin V PI CY5.5-CD3 FITC-CD4 P