贝伐单抗对体外培养翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用的实验研究.docVIP

贝伐单抗对体外培养翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用的实验研究 　　[摘要] 目的 研究贝伐单抗（bevacizumab）对人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs， Human Pterygium Fibroblasts，HPFs）增殖抑制作用。方法 人翼状胬肉切除后进行体外培养，将其传代第4代～第6代时，分别不同浓度的贝伐单抗（6.25mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL）处理48 h，设对照组，采用噻唑蓝比色法（MTT）检测不同浓度贝伐单抗对体外培养的HPFs增殖的抑制率；免疫组织化学技术检测HPFs增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果 MTT结果显示，贝伐单抗组HPFs可见不同程度的抑制作用，PCNA阳性表达率有不同程度的下降，浓度越高抑制作用越明显，且不同浓度各组间比较差异有统计学意义（P0.05）。对照组对HPFs无明显抑制作用，各用药组与对照组差异有统计学意义（P0.05）。结论 贝伐单抗对HPFs的增殖有明显抑制作用，并与药物剂量和作用时间有相关性。 　　[关键词] 人翼状胬肉；成纤维细胞；贝伐单抗；增殖抑制；体外试验 　　[中图分类号] R777.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（c）-0043-02 　　翼状胬肉（Pterygium）是人类常见的眼表疾病之一，其具体的发病原因和发病机制还不十分清楚。目前临床治疗方法多以手术切除为主，但术后复发率较高，其主要成份是异常增生的成纤维细胞和新生血管[1]，具有类似肿瘤的性质。近期研究表明在翼状胬肉中有血管内皮生长因子（VEGF ，Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）表达，提示VEGF与翼状胬肉的关系密切，参与了翼状胬肉的发生发展[2-4]。贝伐单抗（bevacizumab）作为一种新型的抗VEGF人源化单克隆抗体[5]，具有强大的抗新生血管作用，最初主要用于癌症的治疗。已初步应用于眼科多种新生血管疾病的治疗中并取得明显疗效。2012年1月―2013年12月该文研究贝伐单抗作用于体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用，给临床用药提供理论依据。现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　贝伐单抗（罗氏公司）；DMEM培养液（Hyclone公司）；胎生牛血清（Hyclone公司）；胰蛋白酶（生工生物工程上海有限公司）；SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT、美国Sigma 公司）、CO2细胞培养箱、小鼠抗人PCNA单克隆抗体、倒置相差显微镜、全自动酶标测试仪等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 将手术切除新鲜的翼状胬肉组织，浸泡于生理盐水中（含青霉素300 U/mL、链霉素300 U/mL）30 min，在超净工作台BSS冲洗组织3次，取出残留的血污，并将组织分割成约1 mm×1 mm大小的组织块。用组织块培养法[6]，培养于37 ℃，50 mL/L CO2培养箱中。用SABC免疫组化染色法进行鉴定。试验选用培养的4～6代翼状胬肉成纤维细胞。 　　1.2.2 噻唑蓝比色法（MTT法）检测贝伐单抗对细胞增殖影响 取第4～6代处于对数生长期的代HPFs以含20% 胎生牛血清的DMEM培养液制备为1×105/mL细胞悬液，每孔200 uL分别接种于96孔培养板中培养24 h，共设4组，加入贝伐单抗并使各组在药物终浓度分别为6.25、12.5和25 mg/mL组作为实验组，设对照组。分别培养48 h，原培养液加入5 mg/mL的MTT溶液20 uL，CO2培养箱中继续孵育4 h，吸去100 uL培养液加入甲替溶解液，震荡器低速震荡10 min，静置30 min后，酶联免疫测定仪上测定吸光度（OD）值，测定波长为570 nm，参考波长为655 nm。实验重复3 次，并抑制率计算公式按以下公式计算抑制率：增生抑制率%=（对照组OD值―实验组OD值）/对照组OD值×100%。 　　1.2.3 贝伐单抗对HPFs细胞增殖细胞核抗原（PCNA， Pproliferating Ccell Nnuclear Aantigen PCNA）表达的影响 采用免疫细胞化学法。取对数生长期HPFs细胞1×105 mL接种于预置盖玻片的6孔板，分4组，24 h后换液，加入贝伐单抗并使各组在药物终浓度分别为6.25、12.5和25 mg/mL组作为实验组，设对照组。培养48 h后采用SP法进行胞核染色，胞核呈棕黄色为PCNA阳性。显微镜下计数100个细胞中的阳性细胞数，计算PCNA阳性表达率。 　　1.3 统计方法 　　采用SPSS12.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，实验组与对照组相比，