醛糖还原酶基因5′端（AC）n多态性与糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变的相关性.doc

醛糖还原酶基因5′端（AC）n多态性与糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变的相关性 　　【摘要】 目的：探讨2型糖尿病（DM）醛糖还原酶（AR）基因5′端的（AC）n的多态性与糖尿病肾病（DN）、糖尿病周围神经病变（DPN）易感性的关系。方法：选择本院2型DM患者119例为DM组，根据其同时伴（+）或不伴（-）DN与DPN，将DM组分为四个亚组：DN-/DPN-组、DN-/DPN+组、DN+/DPN-组、DN+/DPN+组；同时选取健康体检者62例为正常对照（CON）组。采用聚合酶链反应（PCR）及尿素/甲酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色法分析各组AR基因的二核苷酸（AC）n串联重复序列的多态标记，比较各组间等位基因频率和基因型频率。结果：各组中Z-2等位基因频率比较差异有统计学意义（P0.05），其中在DN+/DPN+组最高，在DN-/DPN-组最低；Z+2等位基因频率在DN-/DPN-组显著增高，在DN+/DPN+组显著降低，两组比较差异有统计学意义（P0.01）；纯合子Z-2/Z-2基因型频率在DN+/DPN+组显著高于其余各组，而纯合子Z+2/Z+2基因型频率在DN-/DPN-组显著高于其余各组。结论：Z+2等位基因是2型糖尿病患者发生DN及DPN的保护性基因；Z-2等位基因是DN易感基因，而病程和Z-2等位基因可能共同促进了DPN的发生。 　　【关键词】 2型糖尿病； 醛糖还原酶； 糖尿病肾病； 糖尿病性周围神经病变 　　糖尿病肾病（DN）及糖尿病周围神经病变（DPN）均为较常见的糖尿病微血管并发症（DMAP），严重影响患者生活质量。目前大量证据表明遗传因素与环境因素同样在DMAP的发生、发展中起重要作用，醛糖还原酶（AR）基因则是目前最受重视的候选基因之一。本研究旨在探讨山东地区2型DM患者AR基因5′端的（AC）n的多态性与DN、DPN易感性的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 按照1999年WHO诊断标准选择本院2012年3月-2013年8月住院或门诊2型糖尿病患者119例为2型糖尿病（DM）组。根据其同时伴（+）或不伴（-）DN与DPN，将DM组分为四个亚组：DN-/DPN-组、DN-/DPN+组、DN+/DPN-组、DN+/DPN+组。其中DN诊断标准为6个月内连续3次测定UAER≥20 μg/min，并排除其他疾病所致的尿白蛋白异常和肾功能不全；DPN诊断标准：（1）肢体感觉及运动神经障碍症状：如患肢麻木、针刺或灼热样疼痛、蚁行感或踏棉垫感等；（2）深浅感觉明显减退，跟腱反射减退或消失；（3）肌电图检查提示运动神经传导速度（MNCV）、感觉神经传导速度（SNCV）减慢；（4）排除其他原因所致周围神经病变。以上患者排除糖尿病急性并发症及甲状腺、垂体疾病等其他内分泌疾病。同时选取健康体检者62例为正常对照（CON）组，全部研究对象均来自山东地区人群，彼此间无血缘关系。考虑到随年龄增加致机体老化对周围神经病变的影响，本次研究排除年龄65岁的患者，入选的DM患者病程均7年。DM各组空腹血糖（FBG）及糖化血红蛋白（HbA1C）均高于CON组；DM各亚组中，DN-/DPN+组及DN+/DPN+组病程均显著高于其余各亚组，其余指标在各组间差异不明显，见表1。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 基因组DNA提取 取冻存抗凝全血0.5 mL，用solarbio全血基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA，-20 ℃保存。 　　1.2.2 聚合酶链反应（PCR） 引物序列参考文献[1]设计，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：Pr1 5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′，下游引物：Pr2 5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′。PCR反应体系共25 μL：10×Buffer2.5 μL，dNTP、TagDNA聚合酶各0.25 μL，Pr1、Pr2各1.0 μL，模板DNA2.0 μL，灭菌三蒸水18 μL。参数如下：94 ℃预变性5min多30 s，94 ℃变性1min多30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33个循环，末次循环后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL的PCR产物与2 μL加样缓冲液混匀后，于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳（100 mV，15 h），保持低温。凝胶用硝酸银染色法显示结果。 　　1.2.3 DNA测序 选取部分基因型为纯合子的PCR产物送上海生物工程公司进行测序。 　　1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验、方差分析或Q检验，并确认符合Hardy-weinberg平衡，计数资料比较采用 字2检验，以P0.05