当归多糖对血管性认知功能障碍大鼠海马细胞凋亡的影响.docVIP

当归多糖对血管性认知功能障碍大鼠海马细胞凋亡的影响 　　【摘要】 目的 观察当归多糖（AP）对分期双侧颈总动脉结扎法（2-VO）制作的慢性脑低灌注血管性认知功能障碍（VCI）大鼠模型海马CA1区Bcl-2和Bax的表达的影响。方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术组（SO）、模型组（M）、当归多糖A组（APA）（5%）、当归多糖B组（10%）（APB）、尼莫地平组（N）。应用HE染色，免疫组化染色法观察大鼠神经元形态改变和Bcl-2，Bax阳性细胞的表达。结果 SO组大鼠海马CA1区可见少量Bcl-2，Bax阳性细胞表达，M组Bcl-2，Bax阳性细胞数量显著增加（P0.01），其中Bax变化更为显著，Bcl-2/Bax比值较SO组明显降低（P0.05）；APB组Bcl-2阳性细胞数提高显著（P0.01）；APB组Bax阳性细胞数降低显著（P0.01），Bax与Bcl-2的比值与M组相比有明显提高（P0.05）。结论 ①AP对VCI模型大鼠海马CA1区神经细胞具有保护作用，且以APB组显效较著。②AP对VCI模型大鼠海马CA1区神经细胞的保护作用可能是通过上调Bcl-2的表达，相对抑制Bax的表达而实现的。 　　【关键词】 血管性认知功能障碍；当归多糖；Bcl-2；Bax 　　近年来的中药分析研究发现，当归多糖（angelica polysaccharide，AP）有明显的补血活血、免疫促进、抗肿瘤、抗辐射损伤等广泛的药理活性[1]，在疾病的预防和治疗方面具有多途径、多靶点、多环节等优点，具有突出的应用研究价值。但未见AP对慢性低灌注导致的脑功能损害作用的报道。本研究通过观察AP对改良分期双侧颈总动脉结扎（2-VO）法[2]制作的慢性脑低灌注血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment，VCI）大鼠模型海马Bcl-2，Bax蛋白表达的影响，探讨AP对VCI模型大鼠神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 清洁级雄性成年Wistar大鼠40只，体重230±20g。实验前大鼠在安静环境下饲养2d，术前禁食12h，不禁水。Bcl-2免疫组化试剂盒和Bax免疫组化试剂盒：武汉博士德生物有限公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂和DAB试剂盒：北京中杉金桥生物有限公司。参照刘娟等[3]的方法，取新鲜岷当归药材（甘肃康达有限责任公司提供），采用超临界CO2萃取法，实验室自制高纯度AP。 　　1.2 方法 　　1.2.1 动物分组 将40只大鼠称重并排序，采用随机数字表法随机抽取8只为假手术组，另外32只大鼠为造模组。模型复制成功后，按随机数字分为模型组、当归多糖A组、当归多糖B组、尼莫地平组，每组8只。 　　1.2.2 模型制备方法 参照吴章福[2]等的方法，采用改良的分期2-VO制作VCI大鼠模型，10%水合氯醛（0.3ml/100g体重）腹腔注射全身麻醉。术后适量青霉素抗感染，保温，常规饲养。动物苏醒后出现眼睑下垂，眼裂变小说明手术成功[4]。 　　1.2.3 给药方法 根据动物与人体体表面积折算法，术后第4日开始灌胃给药，共28天。APA组：精密称取冻干AP高纯干品5mg，溶于100ml蒸馏水，配制成浓度为5%的溶液，按照大鼠体重1ml/100g灌胃，每日1次。以同样的方法制备APB溶液，浓度为10%。SO组、M组以等量蒸馏水灌胃，每日1次。N组，以120mg溶于81ml水中，以20mg/kg.d的比例给药，按照大鼠体重1ml/100g灌胃，每日1次。 　　1.2.4 取材与固定 第29d，迅速断头处死动物，取冠状切取视交叉后10mm至15mm 脑组织，置于4%甲醛溶液中固定24h，梯度酒精脱水，然后放在蒸馏水中漂洗24h。常规石蜡包埋。 　　1.2.5 显微镜观察及阳性判断 在相同条件下对石蜡切片依次脱蜡脱水进行HE染色并观察组织形态学改变；免疫组化染色观察石蜡切片中Bcl-2和Bax的表达情况。阳性反应产物主要位于细胞浆，免疫阳性细胞质内出现棕黄色颗粒，着色越深阳性反应越强。在400倍光镜下在大鼠海马CA1区随机选择5个视野，做免疫反应阳性细胞数计数，以“个/视野”为单位，结果取5个视野的平均值。 　　1.3 统计学方法 所有实验数据以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS16.0统计学软件进行数据统计分析，组间比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义，P0.01为差异有极显著统计学意义。 　　2 结 果 　　2.1 各组大鼠海马组织形态学比较 光镜下观察，SO组大鼠海马区神经元排列规则，胞质丰富，胞核较大。M组大鼠海马区神经元大量变性、死亡，细胞体积缩小，胞浆浓缩、呈现深红色染色，核固缩、碎裂明显、深染。APA