药理学实验设计--探究CAPE(咖啡酸苯乙酯)对结肠癌多药耐药性的逆转作用.docVIP

实验题目： 探究CAPE（咖啡酸苯乙酯）对结肠癌多药耐药性的逆转作用 实验背景： 结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是人类高发的恶性肿瘤，全球结肠癌的发病率一直居高不下，截止至2011年的统计数据显示，美围CRC每年死亡人数占总死亡人数的9.9%，仅次于肺癌，位于第二位[1]。在我国，截止2005年，结直肠癌发病数和死亡数分别达17.2万和9.9万[2]，死亡率也一直处在比较高的水平，所以说结肠癌一直是很严峻的问题。 CAPE是近几年来研究的抗肿瘤药物，是蜂胶的主要提取物之一。国内外研究表明，蜂胶中的CAPE对黑素瘤、结肠癌和胃癌细胞系的作用极为强烈，表现出抑制癌细胞的特性。[3]有研究显示，CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制可能与CAPE抑FAK—ERK信号转导通路的激活有关[4]，同时，其他研究的结果显示CAPE可以降低JNK—paxillin信号通路的活性，从而在体外抑制人肠癌细胞HT-29的生长[5]。 这些研究目的多在于针对CAPE抑制基因复制或其产物表达的过程，并没有对于CAPE是否能够逆转结肠癌的多药耐药性进行研究，所以我们的课题目的在于探究CAPE能否逆转这种多药耐药性。 实验目的及意义 1. 研究CAPE对于结肠癌的多药耐药性有无逆转作用，探讨CAPE对结肠癌的化疗效果。 2. 该实验针对于当下热点——恶性肿瘤的研究，从CAPE的抗肿瘤作用，从其对多药耐药新逆转作用方面创新思维，培养创新能力。 3. 针对肿瘤的发生机制，多药耐药性的发生基础，从而针对性的进行研究。 4. 针对结肠癌的现状，进行有意义的实验，以确定CAPE的临床应用价值。 实验原理： 此次试验分为两个定量的测定部分，分别为测定5-FU与维拉帕米（VER）和CAPE合用时的的FR值和给药前后肿瘤细胞分泌的P-gp含量，下面为试验中的相关概念、重要信息及必要原理。 多药耐药性 多药耐药（MDR）系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。 在多药耐药性发生过程中，肿瘤细胞高表达的是P-糖蛋白（P－gp），此种糖蛋白能够将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内药物浓度而导致肿瘤耐药[6]。这种糖蛋白是由1281个氨基酸组成的两个完全相同的单体构成，每个单体均有6个跨膜区和1个三磷酸腺苷（ATP）结合点[6]。跨膜区作为膜通道有利于药物转运，而ATP结合点与能量供应有关。大量研究证明，P－gp高表达伴随肿瘤患者预后不良，如低缓解率、高复发率、化疗疗效差、生存期短，可作为肿瘤患者预后的评价指标。 Hamilton等[7]首次发现维拉帕米、环孢菌素A(CsA)能与化疗药物竞争性结合P-gp，可以逆转大肠癌MDR。但其心肾毒性及免疫抑制作用明显，限制了临床应用。 P-gp[8] 1976年，Juliano[9]等在中国仓鼠卵巢癌细胞中，发现了一种与MDR成正相关的高分子糖蛋白，命名为P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）． P-gp由定位于7，q21.1mdr1（multidrug resistance 1）基因编码，属于ABC（APT-binding cassette）簇转运因子，是一种跨膜糖蛋白，由1 280个氨基酸组成，整个分子由完全相同的2个单体构成，每个单体具有6个跨膜区和1个ATP结合位点，跨膜区作为膜通道有利于物质转运，ATP结合位点与能量供应有关[10]．P-gp定位于胞质膜，在人体正常组织中广泛表达[11]，如胃肠道、肝、肾的上皮细胞，脑、睾丸、卵巢、肾上腺的毛细血管。推测其可能与细胞的物质转运和解毒有关，是物种进化过程中抵御有害因素的基础。当正常细胞演变成恶性细胞时，仍继续表达mdr1基因，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性，此为天然性耐药。已证实大约30％的AML患者在初诊时就有P-gp的表达，而大于50％的AML复发患者有P-gp表达[12]。 P-gp的检测方法（综合运用免疫学定量检测方法）[13] Western blot P-糖蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗P-gp 单克隆抗体作为一抗（鼠抗人P-gp），酶标二抗（抗小鼠IgG）进行免疫印迹反应，与底物显色，常用化学发光ECL 底物和DAB 底物，化学发光底物灵敏度大大高于显色底物，较常用。同时，可以用酶标仪测OD450nm值，用标准系列的OD值为纵坐标，标准系列稀释度为横坐标作标准曲线，求出检验标本的浓度。 此方法利用特异性抗体鉴定蛋白质，排除了其它蛋白质的干扰，可同时检测内参半定量蛋白含量，是目前国内外常用的检测蛋白方法。 本实验中，测