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实验七 植物种子不饱和脂肪酸的反相纸层析 一、目的 通过操作练习，初步掌握用纸层析法测定油菜籽中脂肪酸的组成的方法。 二、实验原理 在纸层析中，通常支持相是含水的，移动相是有机溶剂。但是脂肪酸等化合物宜用有机溶剂为支持相和含水溶剂为移动相，这样能更好的进行分配，即“反相纸层析法”。 由于不同的脂肪酸在两相中分配系数不同，所以在层析滤纸上移动速率就有差异，这样就使混合脂肪酸各组分被分开。然后用醋酸铜处理，将脂肪酸转化为相应的铜盐，再用红氨酸显色（也可以不用），即可得到蓝灰色点状层析图谱。 二、实验原理 三、器材和试剂 1、器材 层析缸，层析纸，直尺，铅笔 ，微量移液器等 2、试剂 5%的KOH-CH3OH溶液； 10%石蜡-石油醚溶液； 1M的HCl溶液； 石油醚； 1%的醋酸铜溶液； 0.03%的红氨酸溶液。 四、实验步骤 1、样品制备 ①取10粒成熟的油菜种子于10ml离心管中， 加1ml KOH-CH3OH溶液，并将样品用玻璃棒捣碎，酯化6~8h (40℃)。 ②加入 HCl 1.8ml及1ml石油醚,摇匀约5min，静置分层（上清澄清）。 2、点样 ①在层析纸（10 cmX11 cm）一边约1.5cm处用铅笔轻轻画一条直线，每隔1.5cm点一小点，并编号； ②将层析纸放入石蜡油（10%石蜡-石油醚溶液）中浸透30s，取出晾干； ③在层析纸各编号处用针刺一小孔（孔不能太大），然后取样品上清液10μl， 10μl， 15μl， 15μl， 20μl， 20μl按编号顺序滴入孔洞处。 3、展开溶剂系统与条件 ①将点好样的层析纸直立放入盛有醋酸溶液的长方形层析缸中（使编号朝下） 。醋酸溶液的多少以能浸泡层析纸但液面低于点样处为宜。 ②展开至溶液上升到纸的最上端后，展开完毕，取出层析纸，烘干(烘箱37℃)。 4、显色 ①将层析纸浸入醋酸铜溶液中10 min(摇床，37℃)，使生成脂肪酸铜盐.用清水稍加冲洗，再放入洁净的瓷盘中，用流水漂洗45min左右。 ②将层析纸小心取出，用干毛巾或滤纸吸干大部分水分后，置于40℃烘箱中干燥。 ③将层析纸在红氨酸溶液中一带而过，与脂肪酸铜盐作用,观察蓝灰色的斑点 结果与分析 绘出反相纸层析色谱上五种不饱和脂肪酸的位置的示意图。 思考题 分离不饱和脂肪酸为何要用反相纸层析法？ * * * * 十八碳三烯酸 9,12-十八碳二烯酸 9-十八碳烯酸 二十碳稀酸 13-二十二碳烯酸 *
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