2章 DNA重组课件.ppt

第二章 DNA重组 2.1 DNA的组成和结构（略） 2.2 天然DNA的制备 2.2.1 天然DNA的来源和用途 2.2.2 天然DNA的提取 1、准备生物材料 选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择DNA得率最高的生长期。如: 大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。 植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗。 肝脏DNA：要清除胆囊。 2、裂解细胞 这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤。 原核细胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰冻，超声波等方法； 结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。 3 、分离和抽提DNA 提取总DNA：在裂解液中加适量酚／氯仿／异戊醇或氯仿／异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀DNA，再离心。 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。 提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀，再调节PH至中性，质粒DNA复性后从沉淀物中释出。 除RNA：用RNase水解除RNA， 分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区） 2.2.2.1 大肠杆菌源质粒DNA的提取 碱裂解法*： 原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。 实验步骤 挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5min（两次）。 吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀重悬于100μl 溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 加200μl 溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡！将离心管放置与冰上5min。 加150μl溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20s，使溶液 Ⅲ在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，之后将管置于冰上5min。 4℃离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。 加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），振荡混匀。 4℃离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。 用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀，于室温放置2min。 4℃离心12000g，5min。小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 用1ml70％乙醇溶液洗涤沉淀，4℃离心12000，5min，弃去上清，在空气中使核酸沉淀干燥。 用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μlg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。 2.2.2.2 λ噬菌体DNA的提取 溶源周期 溶菌周期 提取λDNA的原理： 先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使λDNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量λ噬菌体，从中提取线形的λDNA。 提取过程： 溶源菌诱导培养 分离λ噬菌体 λDNA的提取 2.2.2.3 氯化铯法制备植物基因组DNA 材料准备 细胞裂解 DNA分离抽取 2.2.3 DNA的纯化 2.2.3.1 氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法 2.2.3.2 离子交换层析法 用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA 用羟基磷灰石纯化DNA 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 2.2.3.4 “基因纯”试剂纯化 2.2.3.5 从DNA样品中去掉EB 正丁醇（或异戊醇）抽提法 Dowex树脂层析法 2.2.4 DNA的浓缩 乙醇沉淀法 含一价阳离子的DNA溶液＋2体积无水乙醇→沉淀DNA→离心→溶于适量TE缓冲液或无菌水。 条件：-20℃，30 min以上；小于1kb或量较少时，于 - 70℃沉淀，或延长时间。 正丁醇抽提法 DNA溶液＋ 1体积正丁醇→混匀→离心（1600 r/min 1min）→弃上清→重复至所需体积→用水饱和乙醚抽提DNA溶液两次（除正丁醇）→空气中蒸发乙醚。 聚乙二醇浓缩法 DNA溶液→透析袋→置高浓聚乙二醇溶液→ 4℃浓缩至所需体积。 2.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化 2.3.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）