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ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌 　　【摘 要】目的：建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。方法：利用通用引物扩增真菌核糖体转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果：9株真菌测序结果与表型鉴定符合，鉴定出7株临床分离丝状真菌。结论：ITS2测序可以作为临床丝状真菌的分子生物学诊断方法之一。 　　【关键词】丝状真菌； 内部转录间隔区； 测序 　　【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0043—02 　　随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。 　　1 材料和方法 　　1.1真菌菌株 本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。 　　1.2 临床分离丝状真菌 临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。 　　1.3 DNA模板制备 真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。 　　1.4 真菌ITS2序列扩增 通用引物序列[3]ITS86-F：5-gtgaatcatcgaatctttgaac-3，ITS4-R：5-tcctccgcttattgatatgc-3，目的片段194bp～494bp。 PCR反应总体积50μl， 10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。反应条件为94℃预变性10min；94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。取PCR产物5μl，加1μl 6×缓冲液上样，1.5%琼脂糖电泳，使用5μl DL1000分子量标准。 　　1.5 PCR产物测序及序列分析 将PCR产物送华大基因科技公司，对PCR产物纯化后测序，测序引物使用PCR扩增引物。在GenBank中（http：//）应用blastn对获得的基因片段进行同源性检索。 　　2 结果 　　2.1真菌ITS2序列扩增及序列分析 ITS2序列通用引物扩增的9种真菌，电泳显示在200bp～400bp范围内出现阳性条带，阴性对照鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。分别挑选烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌的PCR扩增产物进行测序，测序结果均与表型鉴定的属种符合。 　　2.2临床分离丝状真菌ITS2序列扩增及序列分析 ITS2序列通用引物扩增的7株临床分离丝状真菌，均出现阳性条带。阴性对照鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。测序结果显示，血液来源的菌株鉴定为2例烟曲霉菌和1例马耳尼菲青霉菌， 眼分泌物分离的菌株鉴定为2例镰孢菌，耳道脓液分离的菌株鉴定为2例黑曲霉菌。 　　3讨论 　　丝状真菌种类繁多，传统分类方法对人员要求较高，受培养条件影响，即使常见真菌也可能鉴定错误。真菌核糖体测序方法，能准确阐明临床真菌属种，方法简单、实用，技术要求较低，消除了不同实验者对表型实验结果的观察变异，易于在不同实验室之间建立标准的操作规程，可作为临床微生物实验室真菌常规鉴定工作的重要辅助手段。ITS2是真菌核糖体基因的内部转录间隔区2，常用于真菌的系统进化分析，是分子生物学方法鉴定真菌的理想靶序列[4]。 　　本研究利用真菌ITS2序列扩增及分析方法，准确鉴定出