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PDE5 shRNA对心肌细胞凋亡的保护作用 　　【摘要】 目的 探讨抑制磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体PDE5 shRNA对缺氧缺糖条件下乳鼠心肌细胞的保护作用。方法 培养新生C57BL/6J小鼠心肌细胞，通过缺氧缺糖，建立小鼠心肌细胞缺氧缺糖损伤模型，分实验组（shPDE5）和对照组（Null），实验组：通过构建抑制磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体（PDE5 shRNA），将PDE5 shRNA转染心肌细胞，对照组（Null）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体转染心肌细胞。利用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。结果 与对照组比较，细胞在缺氧缺糖条件下，实验组细胞凋亡明显减少（P0.05）。结论 PDE5 shRNA可明显拮抗缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡。 　　【关键词】 短发夹RNA；干预治疗；磷酸二酯酶5；心肌细胞 　　doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.035 文章编号：1004-7484（2013）-06-2893-02 　　病理性细胞凋亡是心肌细胞丧失的形式之一，是心血管疾病发生和发展的基础[1]。心肌细胞凋亡既是心肌细胞损伤的一种反应，同时又是心功能受损的一个重要参与因素。因此，减少心肌细胞凋亡，可能会减轻心室重构，减轻心肌纤维化，改善心脏功能，抗细胞凋亡成为心力衰竭生物治疗的一个新方向。越来越多的证据表明PDE5与心血管系统疾病有密切的关系。最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表达增加，并且会加重心衰患者的心室重构，可能是由于cGMP/PKG信号的下降，加剧心功能恶化[2]。RNA干扰是近年发现的一种由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，能特异性地抑制靶基因的表达，具有快速、高效、容易操作、序列特异性强等优点[3-4]。本实验通过构建磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体（PDE5 shRNA），研究其对缺氧缺糖条件下乳鼠心肌细胞的保护作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 实验动物新生C57BL/6J小鼠购自大连医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（辽）2008-0002），用于乳鼠心肌细胞的培养。 　　药品与试剂DMEM培养基、FBS购自美国Sigma公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司，cGMP、PKG试剂盒购自美国SantaCruz公司。 　　1.2 方法 shRNA重组腺病毒载体构建我们根据鼠的PDE5A序列设计PDE5短发卡RNA，两个互补PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根据鼠PDE5序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，获得鼠PDE5的shRNA表达载体质粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后将供体注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV，获得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，没有插入shRNA的普通腺病毒载体作为对照组（Null），然后将携带有PDE5 shRNA的腺病毒载体（shPDE5）和普通的腺病毒载体（Null）分别转染HEK 293细胞，放在DMEM和10% FBS混合培养液中培养，通过HEK293细胞扩增病毒，并经离心、提取、纯化制备高滴度重组腺病毒载体。 　　准备和培养转导的心肌细胞按照文献[6]从一日龄C57BL/6J小鼠提取心肌细胞，在含有10%FBS的DMEM培养液中37°C培养24小时，进行心肌细胞的鉴定。 　　分组及给药分为实验组和对照组，实验组（shPDE5）用浓度1X106个/ml的PDE5shRNA腺病毒转染心肌细胞，对照组（Null）转染等量未携带PDE5shRNA的腺病毒载体（Null），在正常条件下培养，培养16小时候在激光共聚焦显微镜下观察鉴定。 　　1.3 原位末端标记分析（TUNEL） 正常培养的心肌细胞，用缺糖Hanks液代替正常培养基，放在37°C饱含95%N2/5%CO2密闭容器中培养，细胞培养8小时之后，利用原位末端标记分析对各组心肌细胞进行细胞凋亡检测。 　　1.4 统计分析 用SPSSl7.0进行统计分析。计数资料以均数±标准差表示，均数比较用单因素方差分析（one―wayANOVA），P0.05，有统计学差异。 　　2 结 果 　　2.1 PDE5shRNA转导