基因工程--工具酶课件.ppt

工具酶 酶的灭活 1.加热 2.酚抽提 * * 第四章 工具酶 工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶,  第一节 限制性内切酶（Restriction Endonuclease）一. 细菌的限制一修饰现象被发现瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNAArber首次从 E.Coli B菌株中分离出Ⅰ型限制酶EcoB美Hopkings大学 H.Smith 从流感嗜血菌中分离 Ⅱ型 限制酶  Arber, Smith获得1978 年Nobel奖 二.限制酶系统分类和命名 1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列限制性内切酶的分类  Ⅰ型: 特异识别、随机切割  Ⅱ型：特异识别、同点切割 Ⅲ型：特异识别、异地切割 通常所指的限制酶即Ⅱ类酶 限制酶特性比较  I型 II型 III型限制与修饰由同一酶承担 是 否 是 酶反应辅助因子 ATP.mg++ SAM mg++ ATP.mg++SAM 识别位点特性 / 4-6bp回文对称 / 切割位点 距离1kb 识别点中 距3?端24-26bp 举例 EcoB BamHI EcoPL 识别位点 TGAN8TGCT G GATTC AGACC 克隆工作中用途 无 有 无 SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸 三.系统命名法  限制性内切酶的命名方法 属名 种 变种 序数  1字母 2字母 1字母  (EcoRI) E co R I (HindIII)H in d III (BamHI) B am H I 四.一般限制酶的识别特点1. 大多数是严格的识别顺序，少数可变2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长3. 多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性  4bp HpaⅠ C ? CGG HaeⅢ GG ? CC 5bp Ava Ⅱ G? GWCC EcoRⅡ ? CCWGG 6bp BamHⅠ G ? GATTC SmaⅠ CCC ? GGG11bp Bg1Ⅰ GCCNNNN ?NGGC 12bp BstXⅠ CCANNNNN ?NTGC N=A, T, G, C 五. 限制酶的切割末端 5?粘端 （EcoR I）  3?粘端 （Pst I） 平端 （Sma I）六.限制酶产生的末端的连接 1. 匹配粘端: 直接连接 2. 平末端: 万能连接 3. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端 或Klenow补平 七.识别位点与切割方式之间的关系 1.识别不同，切割不同  eg: BamHI EcoRI -G GATC ?