蛋白质的研究方法.pptVIP

主要内容 蛋白质对象的选择和样品的获取 蛋白质的检测和鉴定 蛋白质的结构分析 蛋白质生物功能检测 蛋白质对象的选择和样品的获取 直接从生物组织中提纯蛋白—— 蛋白质的分离纯化包括以下过程： 1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。 根据基因组测序获得的信息 （1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。 先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获 得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白 （2）去获得有关基因的cDNA全序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。 3.交替冻融法： 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀 而使细胞胀破。 4.超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。 5.酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对 　细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体 三、去污剂处理溶解膜蛋白 膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂 盐析法 蛋白质的胶体性质： 蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。 此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的 作用。 若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素 ，蛋白质极易从溶液中析出 常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。 缺点： 易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。  HPLC包括： 输液系统：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号 ，并分析显示出来 　⑴液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。 ⑵液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。 　⑶离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 Pr分子有一定的PI，它处在一个由阳极到阴极梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与 　其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。 双向PAGE 凝胶层析 1.凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱; 2. 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱. 3. 而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离 。 Ve＝－b’logMw C’