白桦丹醌通过抑制PC9细胞迁移及PC9诱导的破骨细胞形成阻止肺癌骨转移的实验研究.docVIP

白桦丹醌通过抑制PC9细胞迁移及PC9诱导的破骨细胞形成阻止肺癌骨转移的实验研究 　　【摘要】 目的：研究白桦丹醌在抗人类肺腺癌细胞系PC9骨转移中的作用。 方法：采用左心室注射稳转荧光素酶的PC9细胞构建肺癌骨转移动物模型，研究白桦丹醌对PC9骨转移的抑制作用；采用SRB研究白桦丹醌对PC9的毒性作用，采用transwell迁移实验检测其对PC9体外迁移的抑制作用；采用PC9与Raw264.7共培养构建肺癌诱导破骨形成并用白桦丹醌处理，研究白桦丹醌对PC9诱导形成破骨细的抑制作用。结果：动物实验显示，心室注射PC9细胞40 d后，对照组5只裸鼠均出现明显转移，而用药组虽然也出现4只裸鼠转移，但用药组转移灶的光子值（2 759 200±2 670 290）显著小于对照组（8 732 800±6 191 628）（P0.05）。SRB显示2 μM白桦丹醌对PC9无明显杀伤作用，但可显著抑制PC9的迁移能力及显著抑制PC9诱导的破骨细胞形成，组间比较差异均有统计学意义（P0.05）。结论：白桦丹醌可通过抑制PC9迁移及抑制PC9诱导的破骨细胞形成的方式抑制PC9骨转移，显示其作为抗肺癌骨转移药物的应用前景。 　　【关键词】 肺腺癌； 白桦丹醌； 破骨细胞； 迁移； 骨转移 　　肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症之一。美国每年大约170 000人死于肺癌，占整个癌症死亡总数的30%[1]。与其他恶性肿瘤一样，肺癌的转移是造成治疗失败和患者死亡的首要原因[2]。骨是肺癌最常见的转移部位之一，约30%～40%的进展期肺癌出现骨转移[3]，其中大部分为溶骨性转移。尽管近年来对于癌症骨转移的治疗取得了一定的进步，但肺癌骨转移的中位生存期仍徘徊在半年左右，成为医学界亟待解决的一大难题。研制安全高效的癌症骨转移抑制剂是癌症治疗领域的难点和热点。 　　最近的研究表明，白桦丹醌（Plumbagin）对乳腺癌骨转移及大细胞肺癌的化疗具有一定的作用[4-5]，但目前还没有白桦丹醌用于肺腺癌骨转移研究的相关报道。Li等[4]的研究表明，白桦丹醌在不明显影响Raw264.7增殖的浓度下可有效抑制破骨细胞的形成和活性。鉴于此研究基础，笔者进一步研究白桦丹醌对于肺腺癌骨转移的治疗作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 荧光素酶（luciferase）标记的人肺腺癌细胞系PC9及小鼠巨噬细胞系Raw264.7由华东师范大学―长征医院骨肿瘤联合研究中心惠赠；白桦丹醌粉末、荧光素酶底物（D-luciferin）购自于美国sigma公司；培养皿购自丹麦Corning公司；Trap染色试剂盒购自美国sigma公司，重组鼠RANKL、M-CSF购自美国RD公司；磺酰罗丹明B（suHbrhodamine B，SRB）购于美国Sigma公司；RPMI 1640及α-MEM培养基、胰蛋白酶、小牛血清购自美国Gibco公司；Boyden小室购自美国Millipore公司；其余试剂均为市售分析纯产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 SRB检测白桦丹醌对PC9的毒性作用 将处于对数生长期的PC9细胞按5×103个/孔的密度将细胞接种到96孔板，在37 ℃，5% CO2，95% 湿度的条件下培养，使其贴壁。24 h后更换含有不同浓度白桦丹醌的培养基，每个浓度设3个复孔。48 h后加入25 μL/孔的50%三氯醋酸溶液，4 ℃固定1 h；冲洗5遍，室温晾干；加入SRB染液，室温染色10 min。倒掉SRB染液，用1%冰乙酸洗5遍，室温晾干；再加入100 μL/孔10 mM 的Tris碱液，酶标仪读取OD515（optical density，OD）值。 　　1.2.2 迁移实验 将肿瘤细胞重悬于无血清的RPMI1640培养基，细胞浓度调整为5万/200 μL， 取200 μL接种于穿梭小室的上层，在下面的小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基600 μL。36 h后使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，并在显微镜下拍照，统计迁移的肿瘤细胞。 　　1.2.3 肺腺癌细胞PC9诱导破骨细胞形成实验 将PC9与Raw264.7按照1：10的比例混合接种于48孔板（细胞总数为0.3×104），待细胞贴壁后更换含不同浓度白桦丹醌的培养基。培养基添加M-CSF及 RANKL各10 ng/mL，每3天换液。3～5 d后，经多聚甲醛固定及Trap染色，统计破骨细胞数目。Trap染色按照试剂盒说明书进行。 　　1.2.4 肺腺癌PC9骨转移的检测 将处于对数生长期的PC9细胞消化、重悬于PBS，密度调整为1×105/100 μL。通过左心室注射将细胞接种于4～5周的裸鼠体内（购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。小鼠随机分为DMSO组和白桦丹醌组（