体腔积液薄层液基细胞涂片免疫组化染色方法研究.docVIP

体腔积液薄层液基细胞涂片免疫组化染色方法研究 　　[摘要] 目的 探讨体腔积液薄层液基细胞涂片最佳免疫组化染色方法。 方法 收集有组织学对照的恶性胸水68例，每例选12张石蜡切片，作为A组，将每例胸水用薄层液基细胞术制片36张，随机平均分成B、C、D三组；B组经苏木精-伊红（HE）染色及柠檬酸或EDTA修复退色，做免疫组化双重染色，C组经HE染色，用盐酸方法退色，做免疫组化染色，D组不经HE染色，直接做免疫组化。将结果与A组组织病理诊断比较并进行统计学分析。 结果 各组别诊断准确率分别为A组100%（68/68），B组98%（67/68），C组92%（62/68），D组90%（61/68）；A组与B组确诊率差异无统计学意义（P 0.05），A、B组确诊率高于C组及D组（P 0.05）。 结论 B组方法优于C组和D组，有利于体腔积液中癌细胞鉴别诊断和分类，为临床治疗提供更加可靠的病理诊断。 　　[关键词] 肺癌；体腔积液；薄层液基细胞学检查；抗原修复；退色；免疫组化 　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（a）-0017-03 　　薄层液基细胞技术（thin-layer cytology test，TCT）是20世纪90年代兴起的一项新技术，最早应用于妇科宫颈细胞学检查，并获得了良好的效果[1]。随后人们不断将此项技术应用到非妇科细胞学检查[2-4]，并与传统脱落细胞学涂片比较，具有薄层、背景清晰、面积小、血液成分少、利于显微镜观察等优点，但在癌性体腔积液TCT检查中存在癌细胞比较散在或细胞团不如传统涂片立体感强等不足。经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色癌细胞与间皮细胞的鉴别有时很困难，对癌细胞来源及分类更一筹莫展。体腔积液多数混有间皮细胞，常常需要免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色与癌细胞加于鉴别，并对癌细胞进行分类。IHC染色如果不先经HE染色，则不清楚TCT涂片中是否存在癌细胞或可疑癌细胞（目标细胞）或者TCT涂片是否合格，如果经HE染色而采取不同退色方法，会造成不同结果。有报道使用盐酸、高锰酸钾及草酸等对传统涂片和组织切片HE染色进行退色[5-6]。笔者曾在组织切片上采用抗原热修复方法退色，效果较好[7]。胸水TCT涂片IHC染色，由于每张TCT涂片中的细胞排列是随机的，常规IHC染色针对性较差，往往造成诊断困难，为了准确鉴别间皮细胞与癌细胞以及对癌细胞进行详细分类从而达到确诊目的，本小组采用双重免疫组化（double immunohistochemistry，DIHC）染色，即在一张TCT涂片上，同时显示两种抗原成分[8]，来弥补一些抗体敏感性虽高而特异性低的不足，收到良好效果，现报道如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　收集2009年3月～2012年3月秦皇岛市第二医院病理科肺癌伴胸水转移送检病例68例，年龄45～70岁，中位年龄63岁，64排CT均显示肺内占位病变，伴纵隔淋巴结肿大及胸腔积液。其中9例有锁骨上窝淋巴结肿大、质硬。经气管镜、穿刺活检或切取锁骨上肿大淋巴结等手段，获取组织学标本，并及时经10%中性甲醛固定，石蜡切片，经HE染色和IHC染色确定诊断为：鳞状细胞癌13例，腺癌40例，腺鳞癌6例，神经内分泌癌9例；同时获取新鲜胸水每例500 mL，采用TCT制片。TCT制片设备为康柏液基细胞制片机及配套耗材，由湖南长沙康柏恩医疗科技公司提供。免疫组化染色抗体选为：TTF-1，CK7，CK14，CK18，P63，P40，CgA，Syn，CR1（柠檬酸修复），CR2（EDTA修复），Vimentin，CEA和MC，常规IHC染色采用ElivisionTMPlus，DIHC染色采用Dou MaxVision，细胞通透剂为X-100，所选试剂均购于福州迈新公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 制片 　　将每例活检组织选一蜡块进行切片，厚约4 μm，分别切12张，裱于防脱载玻片上，60℃烤2 h，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡，入水冲洗干净。每个病例抽取新鲜胸腔积液500 mL，立即制片，分取10 mL液体，放入一次性塑料试管，每例取36管，放入低速离心机，1500 r/min，离心10 min，吸取上清液放入洁净试管中留作冲洗液，将沉渣逐一转移到TCT保存液当中，震荡1 min，用制片机制片，肉眼见细胞层较厚时，用同例胸水离心上清液稍加冲洗，使细胞涂层变薄，立即风干固定于95%乙醇液中15 min，取出在60℃烤箱烤15 min，每例制36张TCT涂片。 　　1.2.2 分组及染色 　　将每例胸腔积液36张TCT涂片随机平均分成B、C、D三组，每组12张