CHK1 shRNA—617与卵巢癌Skov3细胞放疗敏感性的研究.docVIP

CHK1 shRNA—617与卵巢癌Skov3细胞放疗敏感性的研究 　　【摘要】 目的：本研究以shRNA干扰CHK1在卵巢癌Skov3细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞凋亡情况。方法：采用shRNA技术沉默Skov3细胞中CHK1的表达，用流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果：X射线照射后4hr和28hr，转染CHK1 shRNA的Skov3细胞的凋亡百分数为21.53%±2.51%、15.30%±2.57%，显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（P0.05），显著高于转染shNC+radiation的Skov3细胞照射组（P0.01），显著高于Control组、shNC组、radiation组（P0.001）。结论：沉默Skov3细胞中CHK1的表达，可以明显提高卵巢癌细胞对X射线照射的凋亡敏感性。 　　【关键词】 CHK1； 卵巢癌 　　细胞周期检测点是保证细胞的遗传物质正确复制并被精确传到下一代的调控机制。检查点激酶1（checkpoint kinase 1 ，CHK1）是细胞周期重要检测点激酶[1]。目前研究提示CHK1的高表达与肿瘤的耐药、不良预后有关。本课题将针对CHK1基因617位点的shRNA表达载体导入Skov3细胞，观察辐射后对Skov3细胞凋亡的影响。 　　1材料与方法 　　1.1主要试剂及仪器 　　人卵巢癌细胞株Skov3细胞购自大连宝生物工程有限公司；pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛制药技术有限公司；BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA ligase购自TaKaRa；LipofectamineTM2000购自Invitrogen ；CHK1的引物购自大连宝生物工程有限公司；CO2培养箱选用日本三洋公司1WCD-175 Sanyo；恒温水浴箱选用北京长安科学仪器厂SBHW2-1；深部X射线治疗机选用飞利浦公司；FACScan流式细胞仪选用美国BD公司。 　　1.2细胞培养 　　用含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养卵巢癌Skov3细胞。 　　1.3载体构建和筛选 　　根据人CHK1基因在GenBank登录号选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择CHK1干扰RNA的靶点，设计shRNA。同时选取无关序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT构建对照载体shNC。取pGPU6/GFP/Neo载体2μg，通过BbsⅠ和BamHⅠ酶切后测序鉴定并用脂质体介导转染shRNA载体。应用RT-PCR和免疫组化筛选出有效的shRNA表达载体CHK1 shRNA-617。 　　1.4照射条件及流式检测 　　转染shRNA后20h，用PBS洗细胞，加2mlPBS后采用飞利浦X线治疗机对Skov3细胞进行照射。照射电压为200kV，电流为10mA，总照射量为2 Gy，剂量率0.287Gy/min。照射后更换新鲜的培养基，继续培养4h或28h（转染后24h或48h）收集细胞，PBS洗3次，每次离心800rpm，5min；AnnexinV/PI染色10min，PBS洗3次。应用BD 公司流式细胞仪检测、分析细胞凋亡。 　　1.5分组 　　选不予任何处理的Skov3细胞作为Control组；转染shNC的Skov3细胞不予任何处理作为shNC组；Skov3细胞经X线照射的作为radiation组；CHK1shRNA-617转染Skov3细胞作为CHK1shRNA-617组；将转染shNC的Skov3细胞给予X线照射作为shNC+radiation组；将CHK1shRNA-617转染Skov3细胞经X线照射的作为CHK1shRNA-617+radiation组。 　　1.6统计学方法 　　应用SPSS14软件进行统计分析，平均值±标准差（± s）的比较采用t检验，以P0.05为有统计学意义。 　　2结果 　　X射线照射后4hr，转染CHK1 shRNA-617的Skov3细胞的凋亡百分数为21.53%±2.51%，显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（t=4.3965，P=0.00130.01），显著高于转染shNC+ radiation的Skov3细胞照射组（t=4.8368，P=0.00070.01），显著高于Control组、shNC组、radiation组（t=20.5540，t=8.7541，t=18.2981，P0.001）。X射线照射后28hr转染CHK1 shRNA-617的Skov3细胞的凋亡百分数为15.30%±2.57%，显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（t=2.8670，P=0.01680.05），明显高于转染shNC+ radiation